海岛棉枯萎病抗性蛋白GbPP2C80及其编码基因与应用

本发明涉及植物学领域，具体涉及海岛棉枯萎病抗性蛋白gbpp2c80及其编码基因与应用。

背景技术：

1、枯萎病是由尖孢镰刀菌引起的一种维管束病害，严重影响着棉花生产。在中国，枯萎病菌7号生理小种的分布最广且毒力最高。发生枯萎病的棉区，叶片和蕾铃大量脱落，轻则减产10％，重则30％-50％，且棉花的品质明显下降。海岛棉易感枯萎病，但目前鉴定和克隆到的海岛棉枯萎病抗性基因极少。挖掘重要的海岛棉枯萎病抗性基因并解析海岛棉抗枯萎病的分子机制，具有重要的理论指导意义和实际应用价值。

2、蛋白磷酸酶2c(pp2c)是一类单体丝氨酸/苏氨酸残基蛋白磷酸酶，能使蛋白去磷酸化。拟南芥蛋白磷酸酶pll4和pll5和烟草蛋白磷酸酶pic1是模式触发免疫的负调控因子。然而，目前尚未有关于pp2c蛋白调控海岛棉枯萎病抗性的报道。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何调控植物的枯萎病抗性。

2、为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种蛋白质。

3、本发明提供的蛋白质可为如下任一种的蛋白质：

4、a1)氨基酸序列如seq id no.3所示的蛋白质；

5、a2)将a1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控植物枯萎病抗性的蛋白质；例如本领域技术人员可根据如seq id no.3所示的氨基酸序列以及氨基酸的保守性替换等本领域常规技术手段，在不影响其活性的前提下，通过取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到与如seqid no.3所示的氨基酸序列具有相同功能的蛋白突变体；

6、a3)在a1)或a2)的n末端或/和c末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。

7、上述a1)所述蛋白质的名称为gbpp2c80。

8、为了使a1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中seq id no.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。

9、上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

10、所述标签蛋白包括但不限于：gst(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、his6标签蛋白(his-tag)、mbp(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、flag标签蛋白、sumo标签蛋白、ha标签蛋白、myc标签蛋白、egfp(增强型绿色荧光蛋白)、ecfp(增强型青色荧光蛋白)、eyfp(增强型黄绿色荧光蛋白)、mcherry(单体红色荧光蛋白)或avitag标签蛋白。

11、本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质gbpp2c80的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质gbpp2c80的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质gbpp2c80且具有蛋白质gbpp2c80功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

12、上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

13、本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

14、本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

15、本文中，所述90％以上的同一性可为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

16、上文中，所述蛋白质来源于海岛棉(gossypiumbarbadensel.)。

17、本发明还提供了与上述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料可为下述中的任一种：

18、b1)编码前文所述蛋白质的核酸分子；

19、b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；

20、b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；

21、b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；

22、b5)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

23、b6)含有b1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有b2)所述表达盒的转基因植物组织；

24、b7)含有b1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有b2)所述表达盒的转基因植物器官；

25、c1)抑制或降低或沉默前文所述蛋白质的编码基因表达的核酸分子；

26、c2)表达c1)所述核酸分子的编码基因；

27、c3)含有c2)所述编码基因的表达盒；

28、c4)含有c2)所述编码基因的重组载体、或含有c3)所述表达盒的重组载体；

29、c5)含有c2)所述编码基因的重组微生物、或含有c3)所述表达盒的重组微生物、或含有c4)所述重组载体的重组微生物；

30、c6)含有c2)所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有c3)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有c4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

31、c7)含有c2)所述编码基因的转基因植物组织、或含有c3)所述表达盒的转基因植物组织、或含有c4)所述重组载体的转基因植物组织；

32、c8)含有c2)所述编码基因的转基因植物器官、或含有c3)所述表达盒的转基因植物器官、或含有c4)所述重组载体的转基因植物器官。

33、上述生物材料中，b1)所述核酸分子为如下e1)或e2)所示的基因：

34、e1)编码序列是seq id no.1的cdna分子或dna分子；

35、e2)核苷酸序列是seq id no.2的cdna分子或dna分子。

36、seq id no.1所示的dna分子(调控植物抗病性的gbpp2c80基因)编码氨基酸序列是seq id no.3的蛋白质。

37、seq id no.1所示的核苷酸序列为蛋白质gbpp2c80编码基因(cds)的核苷酸序列。

38、seq id no.2所示的核苷酸序列为蛋白质gbpp2c80的基因组的核苷酸序列。

39、本发明所述的gbpp2c80基因可以为任意能够编码蛋白质gbpp2c80的核苷酸序列。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

40、b1)所述核酸分子还可包括在seq id no.1所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。

41、b1)所述核酸分子还可包括与seq id no.1所示的核苷酸序列一致性为95％以上且来源相同种属的核酸分子。

42、本文所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如grna、mrna、sirna、shrna、sgrna、mirna或反义rna。

43、本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或m13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、ti质粒或病毒载体。具体可为载体pclcrva和p35s::gfp载体。

44、可用现有的植物表达载体构建含有gbpp2c80基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括但不限于如双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3'端，如包括但不限于农杆菌冠瘿瘤诱导(ti)质粒基因(如胭脂合成酶nos基因)、植物基因(如大豆贮藏蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。

45、使用gbpp2c80基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，包括但不限于如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、玉米的泛素启动子(ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

46、为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入包括但不限于可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

47、利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的gbpp2c80基因或基因的片段导入植物细胞或受体植物，可获得植物枯萎病抗性改变的转基因细胞系及转基因植株。携带gbpp2c80基因的表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

48、作为一个具体实施例，上述所述重组载体为重组载体pclcrva-gbpp2c80。所述重组载体pclcrva-gbpp2c80是将pclcrva载体(出发载体)序列spe i和pac i识别位点之间的片段替换为seq id no.4所示dna分子，保持pclcrva载体(出发载体)的其它核苷酸不变得到的重组载体。

49、作为一个具体实施例，上述所述重组载体为重组载体p35s::gbpp2c80-gfp。

50、所述重组载体p35s::gbpp2c80-gfp是将质粒p35s::gfp的限制性内切酶kpn i和xba i识别序列间的小片段替换为序列表中序列1所示的dna分子(去掉终止密码子tga)保持p35s::gfp载体的其他序列不变得到的重组表达载体。

51、重组质粒p35s::gbpp2c80-gfp表达序列表中序列3所示的gbpp2c80蛋白。重组质粒p35s::gbpp2c80-gfp含有gbpp2c80-gfp融合蛋白的表达盒，该表达盒中启动gbpp2c80基因转录的启动子是35s启动子。

52、所述重组微生物具体可为重组农杆菌gv3101/gbpp2c80-gfp。

53、所述重组农杆菌gv3101/gbpp2c80-gfp是将所述重组载体p35s::gbpp2c80-gfp导入根癌农杆菌gv3101得到的重组菌。

54、本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(escherichia)，欧文氏菌(erwinia)，根癌农杆菌属(agrobacterium)、黄杆菌属(flavobacterium)，产碱菌属(alcaligenes)，假单胞菌属(pseudomonas)，芽孢杆菌属(bacillus)等。具体可为根癌农杆菌gv3101。

55、本发明还提供了前文所述蛋白质gbpp2c80或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在下述任一中的应用：

56、u1)所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物枯萎病抗性中的应用；

57、u2)所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控植物枯萎病抗性的产品中的应用；

58、u3)所述的蛋白或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在培育植物枯萎病抗性的植物中的应用；

59、u4)所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备培育枯萎病抗性的植物的产品中的应用；

60、u5)所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在植物育种中的应用。

61、本文中，调控所述蛋白质活性和/或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质gbpp2c80。

62、上述应用中，所述调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质为与所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料可为下述b1)至b7)中的任一种：

63、b1)编码前文所述蛋白质的核酸分子；

64、b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；

65、b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；

66、b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；

67、b5)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

68、b6)含有b1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有b2)所述表达盒的转基因植物组织；

69、b7)含有b1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有b2)所述表达盒的转基因植物器官；

70、c1)抑制或降低或沉默前文所述蛋白质的编码基因表达的核酸分子；

71、c2)表达c1)所述核酸分子的编码基因；

72、c3)含有c2)所述编码基因的表达盒；

73、c4)含有c2)所述编码基因的重组载体、或含有c3)所述表达盒的重组载体；

74、c5)含有c2)所述编码基因的重组微生物、或含有c3)所述表达盒的重组微生物、或含有c4)所述重组载体的重组微生物；

75、c6)含有c2)所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有c3)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有c4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

76、c7)含有c2)所述编码基因的转基因植物组织、或含有c3)所述表达盒的转基因植物组织、或含有c4)所述重组载体的转基因植物组织；

77、c8)含有c2)所述编码基因的转基因植物器官、或含有c3)所述表达盒的转基因植物器官、或含有c4)所述重组载体的转基因植物器官。

78、上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的rna转运进行的调控(也就是对所述基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mrna降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

79、本发明还提供了一种调控植物枯萎病抗性的方法，包括调控目的植物中前文所述蛋白质的活性和/或含量，或/和所述蛋白质的编码基因的表达量，来调控植物枯萎病抗性。

80、上述方法中，所述调控目的植物中所述蛋白质gbpp2c80的活性和/或含量，或/和所述蛋白质的编码基因的表达量包括向受体植物中导入所述蛋白质的编码基因gbpp2c80，得到植物枯萎病抗性改变的目的植物；所述gbpp2c80编码基因编码所述蛋白质gbpp2c80。

81、所述导入指通过重组手段，包括但不限于农杆菌(agrobacterium)介导的转化，生物射弹(biolistic)方法，电穿孔，in planta技术，等等导入。

82、上述应用及方法中，所述调控可为提高、增强或上调。

83、上述应用及方法中，所述调控可为抑制、降低或沉默。

84、为了便于对转基因细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色反应的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。上述方法得到的植物可为转基因植物，也可为通过杂交等常规育种技术获得的植物。上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

85、本发明还提供了一种培育植物枯萎病抗性改变的植物的方法，包括：1)抑制或降低或沉默目的植物中前文所述蛋白质的编码基因的表达量，或/和抑制或降低或沉默前文所述蛋白质的编码基因的活性和/或含量，得到枯萎病性提高的植物；2)提高、增强和/或上调增加目的植物中前文所述蛋白质的编码基因的表达量，或/和提高、增强和/或上调前文所述蛋白质的编码基因的活性和/或含量，得到枯萎病抗性性降低的植物。

86、作为本发明的一种实施方案，所述培育枯萎病抗性植物的方法包括如下步骤：

87、(1)构建抑制或降低或沉默前文所述蛋白质(所述蛋白质的氨基酸序列为序列3)的编码基因的重组表达载体；

88、(2)将步骤(1)构建的表达载体导入植物中；

89、(3)经筛选和鉴定获得抗枯萎病植物。

90、在一个具体的实施例中，培育枯萎病抗性提高的植物的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中的编码gbpp2c80蛋白的核酸分子表达，得到枯萎病抗性提高的转基因植物。所述抑制目的植物中的编码gbpp2c80蛋白的核酸分子表达具体可通过向目的植物中导入以编码gbpp2c80蛋白的核酸分子为靶标的干扰载体实现。所述抑制目的植物中的编码gbpp2c80蛋白的核酸分子表达具体可通过向目的植物中导入以编码gbpp2c80蛋白的核酸分子为靶标的基因沉默载体实现。

91、所述基因沉默载体可为重组载体pclcrva-gbpp2c80。所述重组载体pclcrva-gbpp2c80是将pclcrva载体(出发载体)序列spe i和pac i识别位点之间的片段替换为seqid no.4所示dna分子，保持pclcrva载体(出发载体)的其它核苷酸不变得到的重组载体。

92、本发明还提供了一种培育枯萎病抗性提高的植物的方法，包括如下步骤：抑制或降低或沉默目的植物中前文所述蛋白质的编码基因的表达量，或/和抑制或降低或沉默前文所述蛋白质的编码基因的活性和/或含量，得到枯萎病抗性提高的植物。

93、本发明中，所述植物育种的目的包括培育枯萎病抗性的植物。

94、上述应用或方法中，所述植物是如下中的任一种：

95、n1)双子叶植物；

96、n2)锦葵目植物；

97、n3)锦葵科植物；

98、n4)棉属植物；

99、n5)棉花。

100、上文中，所述棉花可为海岛棉(gossypiumbarbadense l.)感病品种ii15-3465。

101、本发明基于海岛棉自然群体枯萎病发病率鉴定和全基因组关联分析将海岛棉抗枯萎病遗传位点定位在d03染色体上第1159232位，该变异位于基因gbpp2c80上游1.9kb，gbpp2c80含有一个与海岛棉的发病率显著相关非同义突变t/c(gbar_d03_1162571)。基因gbpp2c80编码一种iic型蛋白磷酸酶，在易感枯萎病的海岛棉中表达量显著高于在抗病海岛棉中的表达量，利用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing，vigs)技术在感病的海岛棉中沉默gbpp2c80后极显著增强了其对枯萎病的抗性。gbpp2c80主要定位在细胞膜上，且在细胞膜上与一个海岛棉抗枯萎病蛋白gbwakl14发生互作。gbpp2c80作为一种新型的海岛棉枯萎病抗性基因，具有一定的理论和应用价值。