GPRC5D抗体及其应用的制作方法

本技术涉及生物，特别涉及gprc5d抗体及其应用。

背景技术：

1、g蛋白偶联受体(g protein-coupled receptors，gpcrs)家族是人体最庞大的膜蛋白家族，目前已发现有800多个成员，广泛参与体内生理活动的调控，影响机体视/嗅/味觉、行为及情绪反应、免疫系统调节等。gpcr具有保守的结构特征，由7个跨膜结构域分割为胞外n端，胞内c端，3个胞外环和3个胞内环。其配体结合域由n端和跨膜区段共同组成，g蛋白结合域由c端和胞内环组成。通过信号级联反应，gpcrs将胞外的生物信号转导至胞内下游最终靶标，最终实现对众多生理活动的调控(程建昕，唐赟.g蛋白偶联受体的结构与功能研究进展.生命科学.2015；27(4):445-452)。加之其在细胞表面有可成药靶点(胞外n端及胞外环)，使得gpcrs成为药物研发的重要靶点之一(alexanders.hauser,mistym.attwood,mathias rask-andersen,helgi b.&david e.gloriam.trends ingpcr drug discovery:new agents,targets and indications.naturereviews drugdiscovery，2017)。截至2021年，已经有近500种靶向gpcr的药物获得fda批准，占所有获批药物的33％。

2、多发性骨髓瘤(multiple myeloma，mm)是血液系统的第二大常见恶性肿瘤，为浆细胞肿瘤，表现为骨髓中浆细胞异常增殖，常伴随单克隆免疫球蛋白或轻链的过度生成。mm可引起破坏性骨损伤，肾损伤，贫血和高钙血症等症状，常见于老年患者(andrew j cowan,damian j green,mary kwok,et al.diagnosis and management of multiple myeloma:areview.jama.2022feb 1；327(5):464-477)。截至2021年，全球每年约有59万人确诊mm。在中国，由于老龄化的加速，mm患病人数呈快速增长的趋势，患者人数由2016年的6.98万人增至2019年的10.19万人，复合增长率达13.5％。多发性骨髓瘤治疗的最新进展包括引入蛋白酶体抑制剂，免疫调节剂和靶向癌细胞表面抗原的单抗药物，以及自体造血干细胞移植等(puph and peking university health science centre’s unpublished data(haveauthorized).based on uebmi and urbmi database,from 2012to 2016in chinese23provinces)。在最新修订的中国多发性骨髓瘤诊治指南中，增加了达雷妥尤单抗(抗cd38)联合治疗内容，针对难治复发性mm增加了car-t疗法(中国多发性骨髓瘤诊治指南(2020年修订).中华内科杂志.2020；59(5))。目前，靶向bcma的单克隆抗体及car-t细胞疗法正在如火如荼地研发中，但对于bcma低表达或阴性相关的复发病例，此类药物的疗效不容乐观。mm治疗的最新进展带来了更高的反应率，改善了无进展生存期和总生存期，但多发性复发和难治性mm患者的预后仍然严峻，对新治疗靶标的医疗需求仍然存在。在骨髓瘤细胞中表达的新标志物，与诸如整体存活率，国际分期系统(iss)和细胞遗传学等临床特征相关，可能在临床前测试中充当替代标志物，甚至可能成为潜在的治疗靶标。开发针对其他靶标的免疫疗法可减轻现有免疫疗法的复发性抗原损失，并有效治疗现有靶点表达低或可变的患者。

3、mm的一种潜在靶标抗原是孤儿g蛋白偶联受体，c类5组d组成员(gprc5d)。gprc5d是人类g蛋白偶联受体的新亚型，与raig1、2、3(视黄酸诱导的基因1、2、3)共同组成了gprcs的c5亚家族。早期的工作发现gprc5d在两种组织表达：毛囊以及来自mm患者的骨髓。系统研究发现在肾脏，胰腺，小肠，脾脏和睾丸中发现了高和中等水平的gprc5d mrna表达，而在肺，结肠，前列腺，胸腺和白细胞中发现了低水平的表达(smith el,harrington k,etal.gprc5d is a target for the immunotherapy of multiple myeloma withrationally designed car t cells.sci transl med.2019,11(485))。同时在产生坚硬角蛋白的分化细胞也发现有gprc5d mrna的表达。mm患者骨髓中发现gprc5d高表达。mrna表达与骨髓浆细胞计数，b2-微球蛋白血浆水平，iss，细胞遗传学[缺失13q14和t(4；14)]和os的相关性将gprc5d确立为一种新的预后标志物。上皮细胞瘤过表达，组织低表达，t辅助细胞和ct表位的存在以及细胞膜的表达，显示gprc5d相比bcma具有更好的特异性。同时研究表明，gprc5d与mm明星靶标bcma互为独立表达，在即使发生了bcma逃逸的模型中，也能很好的清除肿瘤并延长存活期。综上所述，gprc5d是潜在的新型癌抗原，将成为mm治疗的下一个热门靶点。

4、以gprc5d为开发靶标的相关研究和企业布局较少。最为领先的是由强生开发的靶向gprc5d×cd3的双特异性t细胞衔接抗体(bite)talquetamab(jnj-64407564)，目前正处于ii期临床，其次是处于临床i期的由优瑞科和mskcc联合研发的gprc5d car-t。talquetamab的ii临床数据实现了69％的orr。根据其披露的临床前数据，talquetamab的gprc5d靶向端亲和力较弱，为该靶点抗体分子的开发提供了空间(kodandaram p,suzanneedavettal,mark mendonca,et al.at-cell-redirecting bispecific g-protein-coupled receptor class 5member d x cd3 antibody to treat multiplemyeloma.blood.2020apr 9；135(15):1232-1242)。

5、与其他gpcrs家族成员一致，gprc5d具有七个跨膜区段，并在细胞膜中表达。定位在染色体12p13.3上的gprc5d基因包含三个外显子，跨度约为9.6kb。gprc5d蛋白总长345个氨基酸，胞外n端占27个氨基酸，三个胞外环分别占9、22和15个氨基酸。胞外区过短导致gprc5d的免疫原性低，为使用过表达细胞进行免疫和筛选带来难度。

技术实现思路

1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本技术的目的在于提供gprc5d抗体及其应用，用于解决现有技术中的问题。本发明采用gprc5d高表达细胞及gprc5d蛋白进行联合免疫，并在初筛阶段就对抗体与gprc5d在细胞水平的结合进行考察并作为筛选依据，筛选出特异性结合细胞表面gprc5d的高亲和力抗体。该抗体有希望用于gprc5d表达的肿瘤的治疗。

2、为实现上述目的及其他相关目的，本技术第一方面提供一种gprc5d抗体，所述gprc5d抗体包括重链可变区与轻链可变区，所述重链可变区的cdr包括氨基酸序列如seqid no：3所示的vh-cdr1、氨基酸序列如seq id no：4所示的vh-cdr2和氨基酸序列如seq idno：5所示的vh-cdr3；和/或

3、所述轻链可变区包括氨基酸序列如seq id no：6或seq id no：11所示的vl-cdr1、氨基酸序列如seq id no：7所示的vl-cdr2和氨基酸序列如seq id no：8所示的vl-cdr3。

4、本技术第二方面提供一种核苷酸分子，编码前述的gprc5d抗体。

5、本技术第三方面提供一种表达载体，含有前述的核苷酸分子。

6、本技术第四方面提供一种宿主细胞，含有前述的表达载体或基因组中整合有前述的核苷酸分子。

7、本技术第五方面提供一种制备前述gprc5d抗体的方法，其包括，在允许所述抗体表达的条件下，培养前述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体。

8、本技术第六方面提供一种药物组合物，含有前述的gprc5d抗体，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

9、本技术第七方面提供一种试剂盒，含有前述的gprc5d抗体。

10、本技术第八方面提供前述的gprc5d抗体、前述的核苷酸分子、前述的表达载体、前述的宿主细胞、或前述的药物组合物在制备具备至少以下一种功效的产品中的用途：

11、a1)结合膜表面的gprc5d；

12、a2)杀伤表达gprc5d的细胞；

13、a3)治疗表达gprc5d的肿瘤。

14、与现有技术相比，本技术的有益效果为：

15、1、本技术发现了一种新的gprc5d抗体，对膜表面gprc5d具备良好的结合活性，并显著强于对标抗体j&j-10b2。

16、2、本技术的抗体对膜表面猴源gprc5d有较好的交叉结合活性。

17、3、本技术的抗体能有效诱导效应细胞对表达gprc5d的肿瘤细胞的杀伤，并杀伤效果显著强于j&j-10b2。

18、4、本技术的抗体与人源gprc5d的结合亲和力显著强于j&j-10b2。

19、5、本技术的抗体能有效诱导补体对表达gprc5d的细胞的杀伤，其cdc杀伤效果显著强于j&j-10b2。