一种鉴定茶树早生性状的SNP位点、CAPS分子标记及其应用

本发明属于分子标记，一种鉴定茶树早生性状的snp位点、caps分子标记及其应用。

背景技术：

1、茶树(camellia sinensis)作为一种叶用型经济植物，春梢萌发时间是其主要农艺性状之一，萌发早的茶树茶叶产量与品质更佳，因而具有更高经济价值。

2、caps分子标记是将pcr技术和限制性酶切结合为一体的技术。该标记原理为，基因组片段上碱基的突变会引起限制性内切酶识别位点的改变，根据已知序列设计特异性引物，利用特异性引物对snp突变位点进行pcr扩增，通过特异性的限制性内切酶酶切pcr产物，用琼脂糖凝胶电泳检测其酶切产物，电泳结果会出现部分基因型扩增片段可被完全酶切呈2条带，部分基因型扩增片段不被酶切或酶切不完全呈1条或3条带的情况，从而进行单核苷酸多态性分析。研究表明，该技术具有多态性高、共显性、所需dna量少、操作简便、结果稳定可靠等优点。

3、目前鉴定茶树早生品种的方法主要以表型选择为主，分子标记辅助选择应用较少，如简单序列重复标记(simple sequence repeat，ssr)。人工选择茶树早生品种费时费力，不单依赖育种家的经验，而且容易受到环境和基因型影响。这种选择更适用于对简单的质量性状进行选择，多种研究表明茶树春梢萌发是由多基因控制的数量性状。ssr标记虽多态性丰富但开发该标记需要大量引物，成本较高。随着高通量测序技术发展，测序成本的降低使得snp标记迅速发展，逐步取代ssr标记。将snp转化成caps标记或dcaps标记成本较低且适合常规分子生物学实验，已被证实是检测snp的有效手段。

4、中国发明专利cn110016521b公开了一种快速鉴定芽叶早生茶树种质的分子标记方法，该专利涉及的snp标记位点为sc0002405-p269473，其与茶树芽叶萌芽期性状紧密连锁，并根据该snp标记附近的dna序列设计一对dcaps标记引物，利用该引物对不同的茶树种质dna进行pcr扩增、电泳分离及基因型分析即可将芽叶早生茶树种质筛选出来，实现了芽叶早生茶树品种的分子标记辅助育种。该专利将待测茶树种质资源电泳图谱与早生茶树种质资源标准电泳图谱比较，若图谱一致，则判定为芽叶早生茶树品种，但提供的早生茶树种质资源标准电泳图谱中具体茶树品种未指明，但其判定的准确率仅80％，仍有较大的提高空间。此外，该方法采用的dcaps分子标记法，酶切片段相差非常小，常规电泳很难取得理想的分离效果，给带型检测带来困难。

5、中国发明专利cn114350847b提供了3个鉴定早生茶树的snp位点，分别位于舒茶早参考基因组的第四染色体的第179776419位(碱基多态性为a/g)、第五染色体的第97586343位(碱基多态性为c/t)、第九染色体的第163016524位(碱基多态性为c/t)。通过对三个snp位点中的一个、两个或三个进行基因型分析，并根据基因型结果对待选育样本进行筛选，可有效快速的鉴定出早生茶树资源。但其准确性依赖于位点的种类，需要多个snp位点才能达到理想的准确性，增加了鉴定时间与成本。

6、茶树春梢萌发期是一个由多基因控制的复杂性状，易受环境条件影响，利用分子标记筛选早生性状的茶树资源是未来茶树育种的主要方向。但是迄今为止，仍然缺乏可大规模应用与生产的简单、方便、准确的鉴定早生茶树的分子标记或位点，所以开发准确、便捷的早生性状关联的茶树分子标记具有广阔的应用前景。

技术实现思路

1、针对现有技术中caps分子标记辅助鉴定早生茶树资源准确性不理想的问题，本发明利用全基因组关联技术筛选了一种鉴定茶树早生性状的snp位点、caps分子标记，该分子标记可以作为茶树早生品种的辅助鉴定选择，准确性高，操作简单、便捷，能应用于早生茶树资源的大规模筛选。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明的目的之一在于提供一种鉴定茶树早生性状的snp位点，所述snp位点位于茶树4号染色体第227558248位碱基，碱基多态性为c/g，所述snp位点命名为chr04:227558248_c/g。

4、发明人通过对126份茶树材料进行全基因组关联分析，在4号染色体上确定了在茶树春梢萌发有较高表达的tgy040711基因(auxilin-like protein 1)，以其为候选基因，使用r软件将基因tgy040711的分子变异数据与茶树品种春梢萌发表型数据进行关联分析，在该基因的启动子区筛选到1个与茶树早生性状显著关联的snp位点(chr04:227558248_c/g)。

5、本发明的目的之二在于提供一种鉴定茶树早生性状的caps分子标记，所述caps分子标记的核苷酸序列如seq id no:1所示，上述snp位点位于所述核苷酸序列的第350位。

6、经实验验证比对，该非同义snp位点存在c碱基时，扩增片段只能被bstni酶切，当该snp突变为g碱基则不能被酶切。选择位于bstni酶的酶切位点的snp位点前、后大约500bp碱基序列转化为caps标记，caps标记的核苷酸序列如seq id no:1所示。

7、本发明的目的之三在于提供扩增上述caps分子标记的引物，所述引物的序列如下：

8、引物f：5'-ctgccaacttcccttattgttgtt-3'(seq id no:2)；

9、引物r：5'-atgctcaagacgcaacaatcttact-3'(seq id no:3)。

10、本发明的目的之四在于提供一种利用上述的caps分子标记和引物鉴定茶树早生性状的方法，包括以下步骤：

11、(1)提取待测茶树样本dna；

12、(2)以待测茶树样本dna为模板，利用上述引物进行pcr扩增，得到扩增产物；

13、(3)利用限制性内切酶bstni对扩增产物酶切后电泳，得待测茶树样本电泳带型；

14、(4)带型比对与鉴定：若电泳带型为2条带，则待测茶树样本snp位点(chr04:227558248_c/g)的基因型为cc，鉴定待测茶树样本为晚生品种；若电泳带型为3条带，则待测茶树样本snp位点(chr04:227558248_c/g)的基因型为cg，鉴定待测茶树样本为中生品种；若电泳带型为1条带，待测茶树样本snp位点(chr04:227558248_c/g)的基因型为gg，鉴定待测茶树为早生品种。

15、进一步地，每份步骤(2)中所述pcr扩增的反应体系包括：1μl引物f，1μl引物r，1μl模板dna，10μl 2×rapid taq master mix，7μl ddh2o。

16、进一步地，步骤(2)中所述pcr扩增的反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

17、进一步地，每份步骤(3)中酶切体系包括扩增产物5μl，限制性内切酶bstni 0.5μl，10×fastdigest green buffer 1μl，ddh2o 8.5μl；酶切条件为37℃孵育30min。

18、进一步地，步骤(4)中电泳带型为2条带时，条带片段大小分别为138bp、350bp；电泳带型为3条带时，条带片段大小分别为488bp、138bp、350bp；电泳带型为1条带时，条带片段大小为488bp。

19、根据本发明的鉴定茶树早生品种的方法，snp位点为参考基因组类型，即仅带有c等位类型时，用bstni进行酶切，可以酶切开，酶切产物分别为350bp和138bp；基因型为cg的品种含有350bp、138bp、488bp三种条带，而仅带有g等位类型的品种扩增片段利用bstni进行酶切，不能酶切开，条带仍为488bp。

20、本发明的目的之五在于提供并要求保护上述snp位点、caps分子标记、引物在鉴定茶树早生性状以及辅助选择育种中的应用。

21、本发明的目的之六在于提供并要求保护上述方法在辅助选择育种中的应用。

22、本发明涉及一种鉴定茶树早生性状的snp位点、caps分子标记及其应用，属于分子标记技术领域。本发明基于茶树全基因组关联分析数据，找到了与茶树早生性状相关的候选基因tgy040711，在此基因上有1个与目标性状显著关联的snp位点，设计了相关caps引物加以应用。相比现有技术，本发明的有益效果在于：

23、1.本发明在tgy040711基因的启动子区获得了1个与茶树早生性状显著关联的snp位点(chr04:227558248_c/g)，开发出与早生性状紧密连锁的snp-caps分子标记，对鉴定茶树早生性状具有较高的准确性，鉴定早生品种的准确率可达91％以上。

24、2.利用本发明的caps分子标记对12份春梢萌发性状有差异的茶树品种进行多态性验证，对剩余72份茶树种质资源做进一步验证，结果表明，该分子标记与茶树早生性状有显著或者极显著关联。这说明，利用本发明的caps分子标记进行早生性状鉴定具有方便快速，准确率高的优点。

25、3.利用本发明的caps分子标记对6份不同茶树幼苗中snp位点(chr04:227558248_c/g)进行基因型鉴定，并培育验证其春梢萌发表型性状，结果表明与幼苗期的基因型完全一致，说明利用本发明的caps分子标记可以为茶树早生性状的育种材料的早期鉴定与选择提供新途径。

26、4.本发明将筛选到的与茶树早生性状snp位点转化为caps标记，仅通过简单pcr、限制性内切酶酶切和琼脂糖电泳即可完成，且各带型大小相差130bp以上，极易鉴别，因此改法具有准确性高、快速、成本低、鉴定周期短，操作简便等优点。该方法能快速有效的进行茶树早生性评价，辅助选择具有早生性的茶树品系。

27、说明书附图

28、图1为茶树春梢萌发全基因组关联分析曼哈顿图。

29、图2为基因tgy040711突变位点与茶树早生性状关联图。

30、图3为84份茶树资源基因组dna电泳图。

31、图4为实施例3中春梢萌发性状不同的12份茶树资源pcr扩增产物电泳检测图，pcr扩增产物长度为488bp。

32、图5为实施例3中春梢萌发性状不同的12份茶树资源pcr扩增产物经限制性内切酶bstni酶切的凝胶电泳图。

33、图6为对比例1中春梢萌发性状不同的12份茶树资源pcr扩增产物电泳检测图，pcr扩增产物长度为494bp。

34、图7为对比例1中12份茶树资源pcr扩增产物经限制性内切酶drai酶切的凝胶电泳图。

35、图8为72份茶树种质资源pcr扩增产物经限制性内切酶bstni酶切的凝胶电泳图。

36、图9为6份茶树幼苗基因组dna扩增产物经限制性内切酶bstni酶切的凝胶电泳图。