一种IL34基因缺陷小鼠模型的制备方法及其应用与流程

本发明属于生物，具体涉及一种il34基因缺陷小鼠模型的制备方法及其应用。

背景技术：

1、白介素34是在研究细胞与细胞之间信号交流时发现的一种新型的白细胞因子。其mrna可在心、肝、脾、肺、脑、胸腺等多种组织和器官中表达，目前已知在脾脏中表达水平最高。随着研究人员对这一新的白细胞介素进行了广泛的研究，逐渐发现了其与一些疾病的关系，如心血管疾病和自身免疫疾病有关。il-34蛋白是一种同源二聚体蛋白，由241个氨基酸组成，相对分子质量39kd。不同种属的动物具有高度的同源性，人的il-34基因位于16号染色体q22.2上，与鼠的il-34基因同源性为71％，说明il-34在生物进化过程中具有较高的保守性。因此，利用基因剔除的小鼠模型来研究该基因的生理病理机制对于理解il34在人类疾病中的生物学意义具有重要的作用。

2、il-34与m-csf的生物学活性相似，二者具有同样的受体csf1r。m-csf在小鼠及人类的破骨细胞分化形成中具有重要的作用。由于il-34可以代替m-csf参与诱导破骨细胞分化，因此il-34可能是一个潜在的骨和炎症性疾病的药物治疗靶点。又有研究发现，m-csf可通过介导单核巨噬细胞在肺和肝中的抗菌功能，对宿主抵抗肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌等革兰氏阴性菌性肺炎发挥重要的作用。由于il-34与m-csf的生物学功能相似性提示il-34基因在细菌性肺炎的发生发展中可能具有重要的生物学作用。

3、m-csf以亲水方式与csf-1r结合，而il-34以疏水方式与csf-1r结合。体外实验还显示，il-34/csf-1r复合体显示较低的解离动力学，可能与更长的细胞信号通路激活和不同的生物学功能有关。il-34与csf-1r结合可激活多种信号通路，包括细胞外信号调节蛋白激酶1和2、fak、janus激酶(jak)、c-jun氨基末端激酶、p38丝裂原激活的激酶、磷脂酰肌醇3-激酶(pi3k)/akt、nf-кb、stat-3和scr激酶家族。

4、但目前该基因在细菌性肺炎发生发展中体内分子机制和功能研究未得到系统全面的研究。因此我们制备了il34基因剔除的小鼠模型，利用气管滴注lps(脂多糖)造成小鼠肺炎模型，通过小鼠表型研究结合rna-seq测序和生物信息学分析来探究il34基因在lps诱导的小鼠肺炎模型中的免疫调控分子机制。研究结果为临床上肺炎的预防治疗提供新的思路，进一步验证il34以及其调控的信号是否能成为治疗肺炎药物的开发靶点。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种制备il34基因缺陷小鼠模型的构建方法及其验证和应用。该方法采用crispr/cas9技术，通过同源重组的方式，在小鼠il34基因第一个外显子定点插入luciferase-2a-egfp-sv40polya表达框导致il34基因失活。利用该小鼠模型，发明人研究了il34基因在细菌性肺炎发生发展中的分子机制和功能，进一步验证了il34基因以及其调控的信号通路可以成为治疗肺炎药物的开发靶点。

2、本发明第一个方面公开了一种il34基因缺陷小鼠模型的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：

3、a.靶位点筛选：筛选得到低脱靶风险的grna靶位点，所述grna靶位点的序列信息如seq id no:1-2所示；

4、grna-1：cctggggactcgcctggctatact(seq id no:1)；

5、grna-2：gagtggttctactgtaaccatgg(seq id no:2)；

6、b.同源重组载体构建，根据获得的grna位点及插入位点信息，构建同源重组载体；

7、ⅰ.构建基因敲入片段：从左到右依次连接5’同源臂、luciferase、2a肽、egfp、sv40polya和3’同源臂构建得到基因敲入片段；

8、ⅱ.构建同源重组载体：通过in-fusion cloning的方法，将5’同源臂、luciferase-2a-egfp-sv40polya和3’同源臂连入质粒载体，获得同源重组载体；

9、c.基因敲入小鼠构建：

10、将构建得到的同源重组载体、cas9 grna表达载体混合后转染进入胚胎干细胞，转染后的es细胞进行扩增培养，pcr筛选获得正确同源重组的阳性es细胞；

11、将阳性es细胞注射进小鼠的囊胚中，pcr筛选获得f0代重组阳性小鼠；将f0代阳性小鼠与野生型小鼠交配，繁育后，pcr筛选获得f1代重组阳性小鼠。

12、优选地，在pcr过程中，所述pcr的引物对包括5’同源臂的鉴定引物对：引物p1，其序列如seq id no:3所示，和引物p2，其序列如seq id no:4所示；以及3’同源臂的鉴定引物对：引物p3，其序列如seq id no:5所示，和引物p4，其序列如seq id no:6所示。

13、本发明第二个方面公开了所述的il34基因缺陷小鼠模型在筛选预防和/或治疗肺炎药物中的应用。优选地，所述肺炎为il34基因参与的细菌性肺炎。

14、本发明第三个方面公开了一种治疗细菌性肺炎的药物，所述药物包括以下物质的一种或其组合，和药学上可接受的辅料：

15、i)、敲除或敲低il34基因的表达载体；

16、ii)、含有i)的宿主细胞或病毒载体；

17、iii)、干扰il34基因转录的核酸分子；

18、iv)、il34基因表达的终止子或转座子；

19、v)、抑制il34基因表达的制剂；

20、vi)、il34蛋白功能的抑制剂和/或拮抗剂。

21、优选地，所述干扰il34基因转录的核酸分子包括：靶向il34基因的rnai片段、靶向il34基因的sirna片段或促进il34信使rna降解的crispr grna。

22、优选地，所述il34蛋白功能的抑制剂和/或拮抗剂包括：il34中和抗体、il34的化学小分子抑制剂和/或il34的多肽类抑制剂。

23、优选地，所述抑制il34受体功能的抑制剂由培西达替尼组成。

24、作为本发明的一种优选的实施例，可以将所述药物与抗炎药sb203580联合使用，能够实现协同增效。

25、本发明中，所述药物的剂型选自片剂、胶囊剂、丸剂、糖锭、粉剂、糖浆剂、酏剂、混悬剂、溶液剂、乳剂或气雾剂。

26、一些实施例中，药学上可接受的辅料包括以下类型的赋形剂：稀释剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、造粒剂、包衣剂、润湿剂、溶剂、共溶剂、助悬剂、乳化剂、甜味剂、调味剂、气味遮蔽剂、着色剂、抗结块剂、保湿剂、螯合剂、增塑剂、增粘剂、抗氧化剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂和/或缓冲剂中至少一种。

27、本发明还提供了一种开发治疗和/或预防细菌性肺炎相关疾病药物中的应用，其为给予本发明所述的药物。具体的，该治疗治疗和/或预防细菌性肺炎药物中的方法为其包括向有需要的受试者施用有效量的如上所述的药物。

28、本发明中，所述药物的给药方法包括口服、吸入、肠胃外途径。所述胃肠外途径包括皮下注射、肌肉内注射、静脉内注射或皮内注射。

29、与现有技术相比，本发明有如下优势：

30、本发明公开了一种基因缺陷小鼠模型，建立该小鼠模型的方法，以及该小鼠模型的用途。在本发明中利用基因修饰的技术，在il34基因第一个外显子处定点插入luciferase-2a-egfp-sv40polya表达框从而导致内源的il34基因失活。进一步实验验证了该基因被有效失活。该基因缺陷小鼠模型的遗传稳定，可用于il34基因在小鼠体内的生理和病理功能研究。特别对于揭示该基因调控的炎症信号通路以及验证其是否作为抗炎药物开发靶点具有重要的作用。