本发明涉及分子生物学，具体而言，涉及一种tpi-1中和单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术：
1、胃癌是一种很常见且死亡率较高的消化道恶性肿瘤，据最新的研究报道，其发病率和死亡率分别排所有恶性肿瘤的第五位(5.6％)和第四位(7.7％)，每年新发胃癌患者就有约100万例，而在中国每年新发患者就将近达到了50万例，占全球新发病例的一半，给我国公共卫生健康带来了巨大的压力。早期胃癌一般采取内镜下切除术、胃部分切除术等，对于进展期胃癌采用根治手术为主、辅助化疗、新辅助化疗、免疫治疗、靶向治疗等综合性的治疗策略，晚期转移性胃癌或复发等患者常失去手术机会，姑息治疗和药物治疗是唯一的治疗手段。
2、药物治疗一般采取铂类、氟尿嘧啶类、多西紫杉醇类及拓扑异构酶抑制剂等联合用药以提高化疗疗效，但其毒副作用不可忽视。目前除了常规化疗方案外，获准用于胃癌的靶向治疗和免疫治疗药物主要有曲妥珠单抗(her2阳性患者一线用药)、雷莫昔单抗(抗vegfr2二线)和纳武利珠单抗或帕博利珠单抗(抗pd-1/pd-l1三线)。然而胃癌患者中仅有约7.3％-20.2％的患者her2表达阳性，在另一项研究表明雷莫昔单抗有效性可能仅有7.4％，而抗pd-1/pd-l1药物有效率也不到15％。克服胃癌治疗难点仍需不断研究新的靶点。
3、代谢重编程也是影响肿瘤细胞增殖的重要因素，代谢重编程是肿瘤细胞为维持自身生长增殖所需巨大能量及物质消耗而将部分代谢过程偏向于利于肿瘤细胞生存的方向，其中一种常见代谢重编程是将氧化磷酸化转向与有氧糖酵解，以支持肿瘤细胞持续增殖所需增加的atp需求，此外还有nadph再生的谷氨酰胺解增加、磷酸戊糖途径产生大分子及脂质摄取合成增加等。事实上，糖酵解增加能够促进肿瘤细胞的增殖这一观点近年来也得到了多篇研究的证明。
4、tpi-1是一种定位于12号染色体短臂p13.31的蛋白编码基因。其编码的蛋白磷酸丙糖异构酶1也称作甲基乙二醛合酶、tpi、tim和tpid等，是一种在细胞代谢活动中发挥重要作用的酶类。该蛋白由两个相同的亚基构成同型二聚体，每一个亚基由249个氨基酸连接而成，蛋白分子量约26.9kd，主要在糖酵解及糖异生过程中发挥作用，催化磷酸二羟丙酮结构异构形成3-磷酸甘油醛，保证糖酵解或氧化磷酸化顺利进行。由于该催化反应具有可逆性，故此，tpi-1也可催化3-磷酸甘油醛向磷酸二羟丙酮的转化，参与糖异生过程。该反应进行的方向由底物的积累水平和产物的消耗水平所决定。磷酸二羟丙酮在细胞代谢过程中还可以转化为α-磷酸甘油，其在脂肪酸合成、脂肪酸β氧化、磷脂合成等脂质代谢过程中起重要作用，3-磷酸甘油醛也是磷酸戊糖途径中的重要分子，由于细胞内代谢的整体性，各种代谢过程是互相联系的，因此，我们认为tpi1影响着糖酵解、糖异生、脂质代谢和磷酸戊糖途径等多个细胞内能量代谢过程。
5、此外，tpi-1也被报道在细胞中能够产生不可忽略的甲基乙二醛，是一种反应性细胞毒性副产物，可通过修饰和改变蛋白质、dna和脂质损伤细胞。目前，tpi-1已经在多种恶性肿瘤中有过报道，研究认为其与恶性肿瘤的发生发展等多方面相关，在恶性肿瘤的早期筛查、预后诊断和作为治疗靶点方面均显现出一定的价值。一项食管癌血清学研究发现，食管癌患者血清中tpi-1自身抗体表达水平升高，可能有助于食管癌患者的早期筛查。该结论在肺癌中也得到了证实，通过检测肺腺癌和肺鳞癌患者与正常人血清中自身抗体，发现tpi-1自身抗体显著升高，通过检测其表达水平可以有效区分肺癌与非肺癌。此外，检测唾液和尿液中tpi-1水平也被认为可能有助于恶性肿瘤的早期筛查和诊断。在与预后生存的关系上，tpi-1的表达水平升高被认为与肺癌的远处转移等不良预后相关，在肝癌上也有类似研究，有研究通过蛋白组学分析发现患者tpi-1过度表达与肝内胆管癌的复发与不良预后显著相关，随后通过队列研究也验证了该结论的准确性。tpi-1与肿瘤细胞耐药发生也有关，一项研究报道，胃癌耐药细胞中tpi-1表达降低，在过表达tpi-1后，细胞内药物积累增加，对化疗药物更加敏感。提出一种tpi-1产生耐药的机制，即tpi-1的核易位能够增强肺癌细胞的耐药性。除了上述作用，tpi-1也被报道与恶性肿瘤的增殖、侵袭以及肿瘤细胞生存等相关，且脱酰胺的tpi-1被认为是一个较好的治疗靶点。
6、有鉴于此，特提出本技术。
技术实现思路
1、基于现有技术存在的问题，本发明目的在于提供一种tpi-1中和单克隆抗体及其制备方法和应用，能够抑制tpi-1蛋白的表达，从而很好的抑制肿瘤细胞的增殖。
2、本发明通过下述技术方案实现：
3、一方面，本发明提供一种tpi-1中和单克隆抗体，所述tpi-1中和单克隆抗体的氨基酸序列包括seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seqid no.6中的一个氨基酸序列或者多个氨基酸序列。
4、在某一具体实施方式中，所述tpi-1中和单克隆抗体的重链可变区的cdr1区域氨基酸序列如seq id no.1所示，其重链可变区的cdr2区域氨基酸序列如seq id no.2所示，其重链可变区的cdr3区域氨基酸序列如seq id no.3所示。
5、在某一具体实施方式中，所述tpi-1中和单克隆抗体的轻链可变区的cdr1区域氨基酸序列如seq id no.4所示，其轻链可变区的cdr2区域氨基酸序列如seq id no.5所示，其轻链可变区的cdr3区域氨基酸序列如seq id no.6所示。
6、在某一具体实施方式中，所述tpi-1中和单克隆抗体包括重链可变区和/或轻链可变区的氨基酸，其中重链可变区氨基酸序列如seq id no.7所示，轻链可变区氨基酸序列如seq id no.8所示。
7、第二方面，本发明还提供一种编码所述tpi-1中和单克隆抗体的核酸分子，包括编码所述tpi-1中和单克隆抗体的重链可变区和/或轻链可变区的核苷酸，其中编码重链可变区的核苷酸序列如seq id no.9所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如seq id no.10所示。
8、第三方面，本发明还提供一种tpi-1中和单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
9、1)将目的基因片段tp1-1插入载体质粒中，筛选含插入片段的阳性克隆并通过测序验证，得到含有正确tpi-1基因序列的表达质粒；
10、2)将所述表达质粒转化至感受态细胞进行培养，挑取单克隆进行诱导表达得到菌液，纯化得到目的表达蛋白，即为tpi-1蛋白；
11、3)将纯化后得到的tpi-1蛋白作为抗原，对免疫动物进行免疫；
12、4)免疫结束后取免疫动物的组织，提取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选阳性克隆，以有限稀释法进行亚克隆，获得杂交瘤细胞；
13、5)将所述杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔制备腹水，将腹水分离、纯化，得到抗tpi-1蛋白的单克隆中和抗体。
14、在某一具体实施方式中，tpi-1中和单克隆抗体的制备方法具体步骤如下：
15、1)根据tp1-1的蛋白质序列，按照大肠杆菌(escherichia coli)的密码子偏好，人工合成目的基因并插入指定载体pet-32a，筛选含插入片段的阳性克隆并通过测序验证，得到含有正确tp1-1基因序列的原核表达质粒；
16、2)将原核表达质粒转化于bl21 de3感受态细胞，接种抗性lb平板培养基，生长过夜，挑取单克隆进行诱导表达得到菌液，纯化得到目的表达蛋白，即为tp1-1蛋白；
17、3)将纯化后的tp1-1蛋白与弗氏完全佐剂充分乳化混合后采用背部多点注射免疫5-8周龄小鼠，通过elisa法检测小鼠抗血清效价；
18、4)免疫结束后，选定要融合的小鼠，取脾收集脾细胞，与骨髓瘤细胞sp2/0融合，通过elisa筛选阳性克隆，然后对复筛的阳性细胞以有限稀释法进行两轮亚克隆并复筛，获得能够抑制tpi-1表达的阳性细胞株及亚型；
19、5)将阳性细胞注射至balb/c小鼠的腹腔，取腹水并进行纯化，得到tp1-1蛋白的单克隆中和抗体。
20、在某一具体实施方式中，步骤5)中腹水纯化的具体方法如下：腹水离心，吸出淡黄色液体计算体积；将proteina/g填料装入重力纯化柱内，用pbs洗涤三次，每次用10x柱体积的pbs；将腹水装入柱子内，4℃温和混匀2-4h；放出流穿液，备用；用pbs洗涤proteina/g填料三次，用预冷的ph3.0 hcl-glycine洗脱液洗脱抗体，收集下的抗体立即用10xpbs中和液中和；检测抗体浓度，合并高浓度收集管；装洗脱下的浓度较高的抗体；对pbs透析，4℃透析过夜。
21、第四方面，本发明还提供一种tpi-1中和单克隆抗体的应用，用于制备治疗恶性肿瘤药物。
22、在某一具体实施方式中，具体应用方法为采用光敏材料mso2负载tpi-1中和单克隆抗体制得治疗恶性肿瘤的药物，所述恶性肿瘤为胃癌、食管癌或肺癌。
23、本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
24、本发明实施例提供的一种tpi-1中和单克隆抗体及其制备方法和应用，能够抑制tpi-1蛋白的表达，从而很好的抑制肿瘤细胞的增殖。