BK病毒肾病的尿液miRNA生物标志物组合及其应用的制作方法

本发明涉及生物，具体涉及bk病毒肾病的尿液mirna生物标志物组合及其应用。

背景技术：

1、bk病毒肾病(bk virus-associated nephropathy，bkvan)是一种由bk病毒(bkvirus，bkv)感染引起的肾脏疾病，严重危害人们的健康。bk病毒属于人类疱疹病毒家族，是一种dna病毒，广泛存在于人类的泌尿系统中，尤其常在肾脏中检测到。bk病毒肾病主要发生在器官移植后免疫抑制状态下的受体中。在移植后的早期，由于免疫抑制剂的应用使得受者机的免疫功能受到限制，bk病毒可以进入受者肾脏等器官，并在上皮细胞和肾小管细胞中造成感染和增殖。这种感染所产生的炎症反应和细胞损伤会导致肾小管上皮细胞凋亡坏死加速，最终导致肾脏功能丧失。通常在人体正常的情况下无明显的临床症状，当患者免疫功能降低或受到抑制时bk病毒可以重新激活，原因可能是移植后长期服用免疫抑制剂导致患者免疫功能低下，与抗bk病毒特异性t细胞受到抑制所致有关。据研究报告bk病毒大量激活后，6-10％的肾移植患者因bk病毒感染可致bk病毒肾病，移植肾功能会出现隐匿性的损害，其中约50-70％的bk病毒肾病受者最终可能会移植肾丢失。

2、传统的检测方法包括尿细胞学检查、bkv-dna拷贝数检测和活检组织猴空泡病毒(sv40)染色等，但这些方法存在一定的局限性。尿细胞学检查通常检测尿液中的细胞形态和细胞核变化，对bk病毒特异性的检测有一定限制。尿细胞学检查需要有经验丰富和专业技能的医学专家，对于未经过培训的医务工作者，其检测结果的可靠性会受到影响。尿细胞学检查并不能反映bk病毒的复制状态和病毒数量，无法对患者患病程度和治愈效果进行有效评估。sv40染色技术是一种有创检查，需要进行肾穿刺活检；一旦活检组织中的sv40的数量很低，或者包含sv40的细胞只在特定位置存在，会出现染色的假阳性。由于bk病毒肾病早期表现为bk病毒尿症和bk病毒血症，bkv-dna拷贝数检测肾移植受者尿液、外周血中病毒载量成为临床早期监测疾病变化的重要方法。bk病毒肾病与尿液、血液中bkv dna载量有密切关系，但bkv dna载量只能反应病毒在体液中的含量，并不能反应bk病毒的实时活化程度。血液病毒dna的检测方法特异性高，灵敏度低，不适合于筛选试验；尿液病毒dna的检测方法灵敏度高，特异性低，假阳性率高，诊断精度差。bk病毒发生的dna重组、突变也会使基因组迅速发生改变，导致pcr检测结果失准，对临床治疗造成不利影响。

3、近年来，越来越多的研究表明bk病毒肾病的发展与mirna的异常表达密切相关。mirna是一类长度为20-25nt的小分子rna，通过在转录后水平结合特定mrna的3'utr来调节基因表达。目前已经有使用mirna作为标志物检测bk病毒肾病的技术，但单个mirna检测效果有限。bk病毒存在潜伏感染和激活感染两种状态，这两种状态可能导致不同的mirna表达模式，单纯的mirna拷贝数检测无法区分这两种状态，限制了对bk病毒感染状态的准确判断。除此之外，bk病毒在东亚人群上存在着多个株型，其中最常见的是bk病毒株型-i和株型-iv，对于不同bk病毒株型的预后也存在区别，以单个mirna为标志物只能反映病毒表达量，而无法鉴别bk病毒的具体株型。目前的现有方法是用基因测序技术鉴定bk病毒株型。首先收集患者中的尿液样本，然后使用试剂盒提取bk病毒dna，合成特异性引物pcr扩增病毒dna，再对扩增出的dna进行测序，获取序列信息，最后通过序列对比软件将得到的bk病毒序列与已知的i型和ⅳ型参考序列做对比，根据序列对比结果判断bk病毒是株型i或株型ⅳ。但该技术也存在一些问题，比如费用高昂、耗时较长等缺点。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种bk病毒肾病的尿液mirna标志物组合。使用mirna-b1-5p、mirna-b1-3p和mirna-155-5p组成的生物标志物组合，与单mirna或双mirna相比，提高了检测的准确性。同时，三种mirna作为生物标志物的表达水平，能够帮助判断bk病毒的株型。

2、本发明的第一个目的是提供bk病毒肾病的mirna生物标志物组合，包括mirna-b1-5p、mirna-b1-3p和mirna-155-5p。

3、进一步地，mirna-b1-5p的核苷酸序列如seq id no.1所示，mirna-b1-3p的核苷酸序列如seq id no.2所示，mirna-155-5p的核苷酸序列如seq id no.3所示。

4、进一步地，mirna来源于尿液。

5、本发明的第二个目的是提供用于扩增上述mirna生物标志物的引物组合物，包括：

6、如seq id no.4所示的扩增mirna-b1-5p的正向引物，如seq id no.5所示的反向引物；

7、如seq id no.6所示的扩增mirna-b1-3p的正向引物，如seq id no.7所示的反向引物；

8、如seq id no.8所示的扩增mirna-155-5p的正向引物，如seq id no.9所示的反向引物。

9、本发明的第三个目的是提供bk病毒肾病检测试剂盒，通过检测上述mirna生物标志物组合来检测bk病毒肾病。

10、进一步地，试剂盒包含上述的引物组合物。

11、进一步地，试剂盒还含有：

12、(1)用于合成cdna的逆转录引物，其中mirna-b1-5p的逆转录引物如seq id no.10所示，mirna-b1-3p的逆转录引物如seq id no.11所示，mirna-155-5p的逆转录引物如seqid no.12所示；

13、(2)taqman探针，其中，mirna-b1-5p的探针序列如seq id no.13所示，mirna-b1-3p的探针序列如seq id no.14所示，mirna-155-5p的探针序列如seq id no.15所示。

14、进一步地，用于合成cdna的逆转录引物为特异性茎环引物。

15、进一步地，采用上述试剂盒进行检测的方法包括以下步骤：

16、(1)收集待测尿液样本；

17、(2)提取尿液中总rna，逆转录为cdna；

18、(3)以cdna为模板，使用基于taqman探针的荧光实时定量pcr技术检测mirna标志物在尿液中的表达量；

19、(4)计算综合诊断得分y，其中，y＝33.55+βmirna-b1-5p×(-0.3190)+βmirna-b1-3p×(-0.4529)+βmirna-155-5p×(-0.2054)，β是在该公式中的自变量；该值是荧光定量pcr的结果呈现形式，用于计算基因表达量差异或基因拷贝数。

20、当综合诊断得分小于37时，认为检测结果为阳性，待测人患有bk病毒肾病或患病风险较高；当综合诊断得分大于37时，认为检测结果为阴性，待测人患bk病毒肾病或患病风险较低。

21、本发明的第四个目的是提供上述mirna生物标志物组合在在制备bk病毒株型鉴别产品中的应用。

22、本发明的第五个目的是提供上述试剂盒在制备bk病毒株型鉴别产品中的应用。

23、进一步地，当采用上述试剂盒进行bk病毒株型检测时，在综合诊断得分小于37的情况下，起始拷贝数高于7.15log copies/ml，检测样本为bk病毒株型i，起始拷贝数低于7.15log copies/ml，检测样本为bk病毒株型ⅳ。

24、本发明的有益效果：

25、(1)以mirna-b1-3p、mirna-b1-5p和mirna-155-5p作为生物标志物进行诊断，其准确性要高于使用单mirna或使用其中任意两个mirna，在筛选得到的所有三种mirna组合中也是准确性最高的。

26、(2)mirna-b1-3p、mirna-b1-5p和mirna-155-5p的生物标志物的表达量在bk病毒不同株型中差异显著，通过生物标志物的表达量结合诊断得分，可以简便快速地判断患者所患bk病毒的具体株型。