一种高产鼠李糖脂的基因工程菌、构建方法及其应用

本发明属于微生物和基因工程，涉及一种高产鼠李糖脂的基因工程菌、构建方法及其应用。

背景技术：

1、鼠李糖脂(rhamnolipids，rl)是铜绿假单胞菌以多种疏水性或亲水性碳源，在好氧条件下发酵生产，结构上主要由一个到两个亲水的鼠李糖元和一条至两条疏水的脂肪酸链拼接而成，在石油开采、环境污染修复、食品、造纸、医药等领域应用潜力大，具有化学表面活性剂所具有的物理化学特性，如去垢、乳化、去乳化、发泡和润湿等作用。与化学表面活性剂相比，鼠李糖脂具有以下优势：环境友好，无毒或低毒，可生物降解，活性高，并且可以在极端环境中保持活性。最重要的是具有环境友好性，易降解，不会对环境造成二次污染，是目前研究最广泛的生物表面活性剂之一。因此鼠李糖脂的特性优良、应用前景广阔。

2、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)具有高滴度合成鼠李糖脂的优越能力，但是它是一种条件致病菌，生物安全性较差。为了解决这一问题，被公认为“公认安全”的恶臭假单胞菌引起了研究人员对鼠李糖脂生物合成的关注。

3、恶臭假单胞菌kt2440(pseudomonas putida kt2440)是gras认证环境安全的假单胞菌属模式菌种，遗传背景清晰，产物的生物合成过程不受细胞群体感应的影响，具有出色的降解环境污染物以及在恶劣条件下的强大生存能力。同时也有着产物的生物合成过程不受细胞群体感应影响的优点，是生产鼠李糖脂的理想细胞底盘。鼠李糖脂的合成依赖于三条代谢途，分别为脂质前体β羟基脂肪酸(haas)合成途径、糖基前体dtdp-l-鼠李糖合成途径以及将脂质前体和糖基前体进行聚合形成鼠李糖脂。其中这三条代谢途分别由3个关键酶rhla、rhlb、rhlc组成的级联反应：其中rhla催化前体β-羟脂酰-acp得到β-羟基脂肪酸(haas)，后者与一分子dtdp-l-鼠李糖在rhlb(鼠李糖基转移酶i)催化下得到单鼠李糖脂，单鼠李糖脂与一分子dtdp-l-鼠李糖在rhlc(鼠李糖基转移酶ii)催化下生成双鼠李糖脂。目前恶臭假单胞菌来生产鼠李糖脂的主要问题是发酵产量不高，通用的做法是：提高恶臭假单胞菌生产鼠李糖脂滴度的策略，即通过合成启动子文库或整合到基因组中来异源表达rhla和rhlb，阻断pha的竞争途径和精简基因组。然而，经代谢工程处理的恶臭假单胞菌仍然存在一定的缺陷与问题，例如生物合成途径的复杂性和鼠李糖脂前体供应的不足导致产量不高的问题。

4、本发明旨在提出一种新型改造策略，赋予恶臭假单胞菌高效表达鼠李糖脂的能力。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明提出了一种高产鼠李糖脂的基因工程菌的构建方法及其应用。本发明提供的高产鼠李糖脂的基因工程菌以恶臭假单胞菌kt2440为底盘菌，通过敲除algd基因、flag基因簇，同时过表达铜绿假单胞菌的rhlab、algc和rmlbdac基因使得恶臭假单胞菌kt2440中的鼠李糖脂产量提高，得到的基因工程菌发酵制备鼠李糖脂具有较高的效价。

2、本发明的目的之一提供了一种高产鼠李糖脂的基因工程菌，其特征在于，包括恶臭假单胞菌和导入恶臭假单胞菌满足自我复制的重组质粒；所述恶臭假单胞菌的基因组中敲除了algd基因、flag基因簇；所述重组质粒为以下之一：(1)包含铜绿假单胞菌pa01的rhlab基因；(2)包含铜绿假单胞菌pa01的rhlab和rmlbdac基因；

3、所述rhlab基因的核苷酸序列如seq id no.9所示；所述rmlbdac基因的核苷酸序列如seq id no.10所示。

4、优选的，本发明所述的恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)的株型为恶臭假单胞菌kt2440。

5、本发明的目的之二在于提供一种高产鼠李糖脂的基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

6、1)以恶臭假单胞菌kt2440为底盘菌，敲除底盘菌基因组中的algd基因、flag基因簇，得到基因敲除突变株；

7、2)构建重组质粒，导入基因敲除突变株中过表达铜绿假单胞菌pa01的rhlab、algc、rmlbdac基因，得到高产鼠李糖脂的基因工程菌。

8、优选的，所述algd基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

9、优选的，所述flag基因簇的核苷酸序列是seq id no.2、seq id no.3、seq idno.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8依次连接。

10、优选的，步骤1)获得所述基因敲除突变株步骤，包括：

11、利用同源重组的方法将恶臭假单胞菌kt2440的algd基因敲除，获得基因敲除突变株kt2440△algd。

12、具体的，步骤1)中的基因敲除突变株kt2440△algd按以下方法获得：

13、以出发菌株恶臭假单胞菌kt2440基因组为模板，利用引物对p1/p2及p3/p4通过pcr扩增得到algd基因的上、下游同源臂片段，再利用引物p1/p4通过重叠pcr技术将两个片段连接起来得到δalgd片段；用hindiii、ecori对ppribmobsacb载体进行双酶切，用c115连接酶将δalgd片段与ppribmobsacb载体连接构建自杀载体pprib-δalgd；

14、通过电击转化的方式将自杀载体pprib-δalgd导入感受态恶臭假单胞菌kt2440中，通过庆大霉素和氨苄霉素共同筛选，利用同源重组敲除algd基因，得到基因敲除突变株kt2440△algd。

15、更优选的，所述引物序列如下：

16、p1：5’-acgacggccagtgccaagcttcagattgatctgccgcaacc-3’；

17、p2：5’-ttgtcgagtgcctcatcgctcccccgtgtataaaggacgt-3’；

18、p3：5’-acgtcctttatacacgggggagcgatgaggcactcgacaa-3’；

19、p4：5’-ctatgaccatgattacgaattcaagatgctggcagccgagaa-3’。

20、优选的，步骤1)获得所述基因敲除突变株步骤，还包括：

21、利用同源重组的方法将恶臭假单胞菌kt2440的flag基因簇敲除，获得基因敲除突变株kt2440△flag。

22、具体的，步骤1)中的所述基因敲除突变株按以下方法获得：

23、以恶臭假单胞菌kt2440基因组为模板，利用引物对p7/p8及p9/p10扩增得到flag基因的上、下游同源臂片段，再利用引物p7/p10通过重叠pcr技术将两个片段连接起来得到δflag片段；ppribmobsacb载体用hindiii、ecori进行双酶切，用c115连接酶将δflag片段与ppribmobsacb载体连接，获得自杀载体pprib-δflag，；

24、通过电击转化的方式将自杀载体pprib-δflag导入恶臭假单胞菌kt2440感受态细胞中，通过庆大霉素和氨苄霉素共同筛选，得到基因敲除突变株kt2440△flag。

25、更优选的，所述引物序列如下：

26、p7：5’-aacgacggccagtgccaagcttaacagcaggatgagcatggacg-3’；

27、p8：5’-gattgtatacaacctgtcgagcccg-3’；

28、p9：5’-cgggctcgacaggttgtatacaatccgcgagtcctcttgatgcaaa-3’；

29、p10：5’-ctatgaccatgattacgaattccatttgctattgcagcacgagagga-3’。

30、优选的，步骤2)中在基因敲除突变株中过表达铜绿假单胞菌pa01的关键基因步骤，包括：

31、将铜绿假单胞菌pa01中的rhlab基因在基因敲除突变株kt2440△algd中过表达，获得基因工程菌rhlab-△algd；

32、将铜绿假单胞菌pa01中的rhlab基因在基因敲除突变株kt2440△flag中过表达，获得基因工程菌rhlab-△flag；

33、将铜绿假单胞菌pa01中的rhlab基因和rmlbdac在基因敲除突变株kt2440△flag中过表达，获得基因工程菌rhlab-rmlbdac-△flag。

34、具体的，步骤(2)中在基因敲除突变株中过表达铜绿假单胞菌pa01的rhlab基因步骤，以铜绿假单胞菌pao1基因组为模板，用引物p13、p14为引物扩增得到rhlab基因片段；用hindiii、xbai对pbbrimcs载体进行双酶切，获得线性化质粒pbbrimcs；然后将rhlab基因片段与线性化质粒pbbrimcs一步克隆后电转至电转感受态恶臭假单胞菌kt2440△algd中，即可获得基因工程菌rhlab-△algd。

35、具体的，步骤(2)中获得基因工程菌rhlab-△flag步骤，包括：以铜绿假单胞菌pao1基因组为模板，用引物p13、p14为引物扩增得到rhlab基因片段；用hindiii、xbai对pbbrimcs载体进行双酶切，获得线性化质粒pbbrimcs；然后将rhlab基因片段与线性化质粒pbbrimcs一步克隆后电转至电转感受态恶臭假单胞菌kt2440△flag中，即可获得基因工程菌rhlab-△flag。

36、优选的，所述引物序列如下：

37、p13：5’-cgacggtatcgataagcttgatgcggcgcgaaagtctgtt-3’；

38、p14：5’-ccgcggtggcggccgctctagatcaggacgcagccttcagcca-3’。

39、具体的，步骤(2)中获得基因工程菌rhlab-rmlbdac-△flag步骤，包括：

40、以铜绿假单胞菌pao1为模板，利用引物对p21/p22，pcr扩增得到的rmlbdac基因；以pbbrimcs-ab-rmlbdac载体为模板，利用引物对p23/p24，pcr扩增出载体骨架pbbrimcs-rhlab-p46，一步克隆后电转至感受态基因敲除突变株kt2440△flag中，获得基因工程菌rhlab-rmlbdac-△flag。

41、优选的，所述引物序列如下：

42、p21：5’-ggaaaacggctaaggaggttttctaatgacgattctcgtgaccggcag-3’；

43、p22：5’-tcaggggaagcagtcggcgt-3’。

44、p23：5’-acgccgactgcttcccctgatctagagcggccgccaccgc-3’；

45、p24：5’-tagaaaacctccttagccgttttcc-3’。

46、本发明还提供了一种基因工程菌在微生物发酵制备鼠李糖脂中的应用。

47、优选的，所述应用包括以下步骤：将基因工程菌接种至含有庆大霉素和氨苄霉素的lb液体培养基中，30℃、200rpm条件下培养12h用作种子液；接种种子液到发酵培养基中，在ph为6.7～7.0、温度为28～35℃的条件下发酵培养，取发酵液，分离提纯得鼠李糖脂；其中，所述lb液体培养基培养基组成：10g/l蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l nacl，溶剂为自来水，ph值自然；庆大霉素在培养基中终浓度为0.025mg/l，氨苄霉素在培养基中终浓度为0.1mg/l；所述发酵培养基组成如下：葡萄糖10g/l、酵母提取物5g/l、蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，溶剂为去离子水，ph值自然。

48、在菌株的代谢中，不同的代谢途径之间存在非线性的关联，以及辅因子的与主代谢途径的竞争和协作关系。本发明提供的提高鼠李糖脂产量的基因工程菌rhlab-△algd，通过在恶臭假单胞菌kt2440基因组中敲除algd基因使更多的葡萄糖-6-磷酸被重新分配到ddtp-l-鼠李糖的支路上，从而使鼠李糖脂的产量提高了16.8％；本发明提供的提高鼠李糖脂产量的基因工程菌rhlab-△flag，通过在恶臭假单胞菌kt2440基因组中敲除flag基因簇使菌株的能量(atp)和还原力(nadph)过剩，从而使鼠李糖脂的产量提高了2倍；本发明提供的高产鼠李糖脂的基因工程菌rhlab-rmlbdac-△flag，在突变株rhlab-△flag的基础上异源过表达来自铜绿假单胞菌pao1的rmlbdac基因簇来增加ddtp-l-鼠李糖的供应，使得恶臭假单胞菌kt2440中的鼠李糖脂产量进一步提高。

49、与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：

50、1)本发明提供的基因工程菌rhlab-△algd通过敲除algd基因使更多的葡萄糖-6-磷酸被重新分配到鼠李糖的支路上，从而使得鼠李糖脂的产量提高了16.7％。

51、2)本发明提供的基因工程菌rhlab-△flag通过敲除flag基因簇使菌株的能量(atp)和还原力(nadph)过剩，从而使得鼠李糖脂的产量提高了2倍。

52、3)本发明提供的基因工程菌rhlab-rmlbdac-△flag在因工程菌rhlab-△flag的基础上过表达了来自铜绿假单胞菌pao1的rmlbdac基因，来增加前体物质ddtp-l-鼠李糖的供应，从而使得鼠李糖脂的产量进一步提高了49.3％。

53、4)本发明提供的基因工程菌应用于微生物发酵生产鼠李糖脂，具有产量高、底物廉价、易分离的特点，具有工业化前景。