一种提高禽类商品活疫苗增殖的方法及应用

本发明涉及dna分子疫苗，更具体的说是涉及一种提高禽类商品活疫苗增殖的方法及应用。

背景技术：

1、马立克氏病(marek’s disease，md)又名神经淋巴瘤病(neurolymphomatosis)，二类传染病，是鸡的一种淋巴组织增生性疾病，以对外周神经、性腺、虹膜、各种内脏器官、肌肉和皮肤的单个或多个组织器官发生单核细胞浸润为特征。本病是由细胞结合性疱疹病毒引起的传染性肿瘤病，导致上述各器官和组织形成肿瘤。

2、免疫接种是预防禽类马立克氏病最经济、有效的策略之一。虽然禽用弱毒疫苗的使用非常广泛，但目前相关研发工作已进入瓶颈阶段，商品化的种类相对较少，质量参差不齐，而临床需求量巨大。此外，传统弱毒疫苗的生产严重依赖spf鸡胚来繁殖病毒，存在不少突出问题，如疫苗的商业化生产需要大量的鸡胚储备，极易出现spf鸡胚供应不足的情况，从而影响疫苗的产量化；其次，spf鸡胚培养过程中极易受到外源微生物的污染；同时，鸡胚尿囊液成分复杂，增大了下游纯化的难度，对疫苗质量有一定的影响；除此之外，该生产工艺存在生产周期长、生产工艺复杂等。与鸡胚培养相比，细胞培养的病毒滴度较高，并具有低成本、批次稳定性高等优点，更符合现代疫苗生产的要求。

3、火鸡疱疹病毒(herpesvirus of turkey,hvt)是一种非致病性细胞结合性甲型疱疹病毒，由于与血清ⅰ型马立克病病毒(marek’s disease virus,mdv)在遗传学和血清学上具有一定的相关性，因此根据病毒学分类，hvt被划分为mdv-3型。vp23是疱疹病毒衣壳蛋白的重要组成部分。vp23与vp19c一起构成衣壳三聚体，在病毒粒子的组装及基因组dna的复制过程中发挥关键作用，影响病毒的生长所必需。

4、因此，开发一种可促进禽类毒株复制增殖的方法，是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种提高禽类商品活疫苗增殖的方法及应用。本发明所获得得商品活疫苗得病毒载量高，生产周期短，安全性高、成本低廉、制作简单、生产高效。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种提高禽类商品活疫苗增殖效率的方法，在bhk-21细胞中表达火鸡疱疹病毒vp23蛋白，利用该蛋白的免疫逃避功能，提高病毒增殖效率。

4、该方法具有周期短，效率高，可以逐级放大生产的优点，从而满足当代对高效病毒疫苗生产工艺的需求。

5、本发明的另一目的是，提供一种稳定表达火鸡疱疹病毒vp23蛋白的重组质粒，所述重组质粒由火鸡疱疹病毒vp23基因和ha标签、egfp基因、自裂解多肽p2a序列重组得到；

6、所述vp23基因如序列表seq id no.1所示。

7、优选的，所述稳定表达火鸡疱疹病毒vp23蛋白重组质粒的构建方法，包括以下步骤：

8、(1)从火鸡疱疹病毒活疫苗(fc-126株)中提取火鸡疱疹病毒基因组，并扩增火鸡疱疹病毒vp23基因；

9、(2)利用限制性内切酶bgiⅱ和hindⅲ将真核表达载体pha-2a-egfp和vp23基因进行双酶切线性化；

10、(3)通过连接反应将vp23基因连接至pha-2a-egfp表达载体上形成重组质粒pvp23-ha-2a-egfp。

11、优选的，所述稳定表达火鸡疱疹病毒vp23蛋白重组质粒的构建方法，步骤(1)所述扩增的引物序列如序列表seq id no.2-3所示；

12、所述扩增的反应体系为20μl：上游引物(vp23-ha-fw)1μl，下游引物(vp23-ha-rv)1μl，2×taq pcr green mix 10μl，基因组dna 2μl，ddh2o 6μl；

13、所述扩增的程序为95℃预变性2min；95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸30s，30个循环；72℃保温5min。

14、优选的，所述稳定表达火鸡疱疹病毒vp23蛋白重组质粒的构建方法，步骤(2)所述双酶切线性化的条件为37℃水浴孵育1h；

15、所述双酶切反应体系为40μl：vp23基因片段/pha-2a-egfp载体15μl，10×fastdigest buffer 4μl，bglⅱ/hindⅲ1μl，ddh2o 4μl。

16、优选的，所述稳定表达火鸡疱疹病毒vp23蛋白重组质粒的构建方法，步骤(3)所述连接反应的条件为：4℃连接12h；

17、所述连接反应体系为20μl：线性化vp23基因片段13μl，线性化真核表达载体pha-2a-egfp 4μl，10×t4 dna fastligase buffer 2μl，t4 dna fastligase 1μl。

18、优选的，所述稳定表达火鸡疱疹病毒vp23蛋白重组质粒的构建方法，还包括步骤(4)连接产物转入感受态大肠杆菌dh5α进行扩增培养。连接产物转化感受态大肠杆菌dh5α，涂布在含有卡那霉素的lb平板，置于37℃培养12～16h，随机挑取20个单个菌落，在含卡那霉素的lb液体培养基中37℃培养12～16h进行菌液扩增，提取质粒。

19、本发明的另一目的是，提供一种促进禽类商品活疫苗增殖的方法，包括以下步骤：

20、(a)将重组质粒转染bhk-21细胞，得重组细胞；

21、(b)验证重组细胞中目的基因的正确表达并筛选出能表达vp23蛋白的阳性细胞；

22、(c)阳性细胞传代并验证vp23蛋白表达，得稳定表达火鸡疱疹病毒vp23蛋白的重组bhk-21细胞。

23、优选的，所述稳定表达火鸡疱疹病毒vp23蛋白的重组bhk-21细胞的构建方法，步骤(a)所述转染方法为：转染剂30003μl，去血清培养基100μl孵育5min；加入1μg重组质粒，孵育15min；将转染体系加入生长密度为70％～80％的1×10^6个bhk-21细胞中，置于37℃、5％co2培养箱中培养48h。

24、优选的，所述稳定表达火鸡疱疹病毒vp23蛋白的重组bhk-21细胞的构建方法，步骤(b)所述验证重组细胞中目的基因的正确表达的方法为ifa和western blotting方法；

25、所述筛选出能表达vp23蛋白的阳性细胞的方法为在含有遗传霉素g418的培养基中连续传代5次重组细胞，筛选出具有表达抗性基因的候选细胞，所述遗传霉素浓度为600μg/ml；再通过流式细胞仪对候选细胞进行分选，筛选能表达hvt-vp23蛋白的细胞。

26、本发明的另一目的是，提供上述任一方法构建的细胞、或上述重组质粒、或上述任一方法构建的重组质粒在火鸡疱疹病毒增殖中的应用。

27、本发明的另一目的是，提供上述任一方法构建的细胞、或、上述重组质粒、或上述任一方法构建的重组质粒在制备禽类疫苗中的应用。

28、有益效果：

29、1.火鸡疱疹病毒作为疫苗载体，优势在于：1)严格的细胞间传递，避免疫苗毒被母源抗体干扰；2)接种后刺激外源基因持续表达，使抗体稳定在较高的水平；3)有大量复制非必需区可供外源基因插入并表达；4)接种hvt的鸡群能产生很好的体液免疫和细胞免疫应答，免疫保护效果可终生维持；5)可制备成冻干品，方便运输和贮存。

30、2.vp23是疱疹病毒衣壳蛋白的重要组成部分，与vp19c一起构成衣壳三聚体，在病毒粒子的组装及基因组dna的复制过程中发挥关键作用，影响病毒的生长所必需。本发明通过转入表达禽源免疫逃避蛋白——火鸡疱疹病毒vp23蛋白的质粒，抑制下调宿主干扰素的产生，促进外源病毒的增殖，利于病毒的复制，本发明利用hvt vp23干扰固有免疫这一特点，使其在哺乳动物细胞系bhk-21稳定表达，可应用于禽类疫苗的研究，显著提高禽类弱毒活疫苗的产量。

31、3.本发明提供的有效促进病毒增殖效率的高产疫苗病毒细胞系，病毒载量高，可稳定传代，具有周期短，效率高，可以逐级放大生产的优点，从而满足当代对高效病毒疫苗生产工艺的需求