m6A识别蛋白YTH结构域相关基因的siRNA及其应用的制作方法

本发明涉及生物，尤其是涉及m6a识别蛋白yth结构域相关基因的sirna及其在疾病治疗方面的应用。

背景技术：

1、m6a(6-甲基腺嘌呤，n6-methyladenosine)甲基化，即在rna腺苷酸(a)第六位的n上发生甲基化修饰，是真核生物rna中最常见的一种转录后修饰，约占rna甲基化修饰的80％左右。

2、m6a rna甲基化是一个动态可逆的修饰过程，该过程需要在m6a甲基转移酶复合物(编码器，writers)、m6a去甲基化酶(消码器，erasers)和m6a识别蛋白(读码器，readers)的参与下催化形成。

3、m6a识别蛋白可以将不同的调节或功能因子募集到含m6a修饰的mrna上，影响靶mrna的命运。含yth结构域的蛋白有保守的m6a结合口袋，是主要的m6a识别蛋白，包括ythdc1-2和ythdf1-3。ythdc1是yth家族蛋白的核心成员，位于细胞核中，识别m6a后可选择性地募集或抑制不同的剪接因子，影响rna的可变剪接。ythdc1还能与剪接因子srsf3、核rna输出因子nxf1相互作用，调控mrna从细胞核向细胞质的输出。ythdc2含多个解旋酶结构域和两个锚蛋白重复序列，优先结合m6a，能提高转录物的翻译效率，同时降低靶mrna的丰度。ythdf1的分布模式与mrna上m6a位点总体一致，可与真核起始因子、核糖体共同作用，增强mrna的翻译效率。ythdf2通过直接募集去腺苷化酶和脱帽酶复合物，将处于翻译池的mrna导向至加工小体，加速m6a修饰转录物的衰变和降解。ythdf3既可以协同ythdf1作用于核糖体蛋白促进mrna翻译，又能与ythdf2合作介导mrna的衰变。然而目前并没有针对m6a识别蛋白的靶向治疗药物，因此，开发针对m6a识别蛋白相关基因靶点的药物尤为迫切。

4、sirna(小干扰rna)是一段与靶基因序列同源的、长度在20-25nt的双链rna，可以特异性地引起具有相同序列的mrna的降解，从而阻断相应基因的表达，进而治疗该基因引起的各类疾病。

5、现有的技术中，目前并没有针对m6a识别蛋白yth结构域相关基因的靶向治疗药物。本发明针对m6a识别蛋白yth结构域相关基因设计sirna并有效干扰基因表达，有望突破m6a识别蛋白yth结构域相关基因引起的疾病治疗方面的瓶颈。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供m6a识别蛋白yth结构域相关基因的sirna及其在疾病治疗方面的应用，其针对m6a识别蛋白yth结构域相关基因设计特异性sirna作为靶向治疗药物，sirna寡聚核酸组合可以有效抑制包含ythdc1、ythdc2、ythdf1、ythdf2、ythdf3在内的m6a识别蛋白yth结构域相关基因的表达，抑制其生物学功能的发挥。

2、本发明的上述发明目的是通过以下技术方案得以实现的：

3、m6a识别蛋白yth结构域相关基因的sirna，包含ythdc1、ythdc2、ythdf1、ythdf2、ythdf3在内的m6a识别蛋白的sirna寡聚核酸组合。

4、作为本发明的进一步的技术方案：所述sirna为一种核酸分子，包括gp-ythdc1-2、gp-ythdc1-3、gp-ythdc1-8、gp-ythdc2-3、gp-ythdc2-5、gp-ythdc2-10、gp-ythdf1-1、gp-ythdf1-9、gp-ythdf1-10、gp-ythdf2-1、gp-ythdf2-3、gp-ythdf2-4、gp-ythdf2-8、gp-ythdf3-1、gp-ythdf3-8、gp-ythdf3-9。

5、作为本发明的进一步的技术方案：所述核酸分子为双链rna分子。

6、作为本发明的进一步的技术方案：所述gp-ythdc1-2由如下序列的正义链和反义链组成：

7、正义链：5’-gucauaugcagguucagaatt-3’，

8、反义链：5’-uucugaaccugcauaugactt-3’；

9、所述gp-ythdc1-3由如下序列的正义链和反义链组成：

10、正义链：5’-caaaccaguaaacucaaautt-3’，

11、反义链：5’-auuugaguuuacugguuugtt-3’；

12、所述gp-ythdc1-8由如下序列的正义链和反义链组成：

13、正义链：5’-gguccuacaaugauuaugutt-3’，

14、反义链：5’-acauaaucauuguaggacctt-3’。

15、作为本发明的进一步的技术方案：所述gp-ythdc2-3由如下序列的正义链和反义链组成：

16、正义链：5’-guuaucagauccgauuagatt-3’，

17、反义链：5’-ucuaaucggaucugauaactt-3’；

18、所述gp-ythdc2-5由如下序列的正义链和反义链组成：

19、正义链：5’-gaagaccauuugaaguaaatt-3’，

20、反义链：5’-uuuacuucaaauggucuuctt-3’

21、所述gp-ythdc2-10由如下序列的正义链和反义链组成：

22、正义链：5’-aguugcuccaguuaugggatt-3’，

23、反义链：5’-ucccauaacuggagcaacutt-3’。

24、作为本发明的进一步的技术方案：所述gp-ythdf1-1由如下序列的正义链和反义链组成：

25、正义链：5’-ccagagaacaaaaggacaatt-3’，

26、反义链：5’-uuguccuuuuguucucuggtt-3’；

27、所述gp-ythdf1-9由如下序列的正义链和反义链组成：

28、正义链：5’-caguaucagagcccucagctt-3’，

29、反义链：5’-gcugagggcucugauacugtt-3’；

30、所述gp-ythdf1-10由如下序列的正义链和反义链组成：

31、正义链：5’-cuggagaauaacgacaacatt-3’，

32、反义链：5’-uguugucguuauucuccagtt-3’。

33、作为本发明的进一步的技术方案：所述gp-ythdf2-1由如下序列的正义链和反义链组成：

34、正义链：5’-ccuacuuacccaguuacuatt-3’，

35、反义链：5’-uaguaacuggguaaguaggtt-3’；

36、所述gp-ythdf2-3由如下序列的正义链和反义链组成：

37、正义链：5’-cagugggauugacuucucatt-3’，

38、反义链：5’-ugagaagucaaucccacugtt-3’；

39、所述gp-ythdf2-4由如下序列的正义链和反义链组成：

40、正义链：5’-cucuggauauaguagcaautt-3’，

41、反义链：5’-auugcuacuauauccagagtt-3’；

42、所述gp-ythdf2-8由如下序列的正义链和反义链组成：

43、正义链：5’-gcaguggguucggucauaatt-3’，

44、反义链：5’-uuaugaccgaacccacugctt-3’。

45、作为本发明的进一步的技术方案：所述gp-ythdf3-1由如下序列的正义链和反义链组成：

46、正义链：5’-gcuguaaaugaugaugauutt-3’，

47、反义链：5’-aaucaucaucauuuacagctt-3’；

48、所述gp-ythdf3-8由如下序列的正义链和反义链组成：

49、正义链：5’-ggacguguguuuauaauuatt-3’，

50、反义链：5’-uaauuauaaacacacgucctt-3’；

51、所述gp-ythdf3-9由如下序列的正义链和反义链组成：

52、正义链：5’-guaguacugagcaugguaatt-3’，

53、反义链：5’-uuaccaugcucaguacuactt-3’。

54、如上述的m6a识别蛋白yth结构域相关基因的sirna在疾病治疗方面的应用。

55、如上述的m6a识别蛋白yth结构域相关基因的sirna的检测试剂盒，包含ythdc1、ythdc2、ythdf1、ythdf2、ythdf3的引物。

56、作为本发明的进一步的技术方案：所述ythdc1由如下序列的上游引物和下游引物组成：

57、上游引物：5’-tcagaatcacatcacggagga-3’，

58、下游引物：5’-gagccgacttagtgaagggtaa-3’。

59、作为本发明的进一步的技术方案：所述ythdc2由如下序列的上游引物和下游引物组成：

60、上游引物：5’-gatgcctttgctcaggtcttt-3’，

61、下游引物：5’-tccagccatttgatgctttact-3’。

62、作为本发明的进一步的技术方案：所述ythdf1由如下序列的上游引物和下游引物组成：

63、上游引物：5’-agcgtggacacccagagaa-3’，

64、下游引物：5’-aatggacggcgggtaatagc-3’。

65、作为本发明的进一步的技术方案：所述ythdf2由如下序列的上游引物和下游引物组成：

66、上游引物：5’-gcctcttggagcagagaccaa-3’，

67、下游引物：5’-aggagaagccaatggagggac-3’。

68、作为本发明的进一步的技术方案：所述ythdf3由如下序列的上游引物和下游引物组成：

69、上游引物：5’-ctactttcaagcataccacctcaa-3’，

70、下游引物：5’-gtttgtttctatttctctccctacg-3’。

71、如上述的m6a识别蛋白yth结构域相关基因的sirna在检测试剂盒方面的应用。

72、综上所述，本发明包括以下至少一种有益技术效果：

73、本发明公开了一种m6a识别蛋白yth结构域相关基因的sirna及其在疾病治疗方面的应用，其m6a识别蛋白yth结构域相关基因设计特异性sirna作为靶向治疗药物，sirna寡聚核酸组合可以有效抑制包含ythdc1、ythdc2、ythdf1、ythdf2、ythdf3在内的m6a识别蛋白yth结构域相关基因的表达，抑制其生物学功能的发挥。