一种基于纤维小体的胞内高产L-赖氨酸工程菌构建方法及应用

本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种基于纤维小体的胞内高产l-赖氨酸工程菌构建方法及应用。

背景技术：

1、纤维小体主要由两部分组成：一部分为含多种类型对接模块锚定结构域dockerin的催化亚基酶蛋白，具有催化功能；另一部分为含多种类型粘连模块黏附结构域cohesin的非催化亚基脚手架蛋白scaffoldins，具有组装功能，参见文献[noach,journal ofmolecular biology，2010，399(2)：294-305；doi,journal of bacteriology，2003，185(20)：5907-5914；bayer,chemical record，2008，8(6)：364-377]。

2、l-赖氨酸生物合成途径有氨基己二酸途径(aaa)和二氨基庚二酸途径(dap)，参见文献[wittmann,microbiology monographs，2007，12(5)：39-69；eggeling,appliedmicrobiology and biotechnology，1999，52(2)：146-153]。除aaa主要存在于高等真菌及古细菌中，dap途径合成底物为l-天冬氨酸，至少经过7步催化反应步骤形成l-赖氨酸，参见文献[sahm,biological chemistry，2000，381(9)：899-910]。

3、目前，提升l-赖氨酸发酵强度主要有两大途径：一是通过启动子、sd序列优化等手段提高l-赖氨酸合成关键酶的表达量；二是通过对合成途径上的酶分子进行改造，提高酶的活性，进而提高l-赖氨酸合成速率。虽然上述途径均可以提高l-赖氨酸的发酵强度，但通常仅考虑到l-赖氨酸合成途径中的一种或几种关键酶，而由于l-赖氨酸的合成途径较长，参与合成的酶数量较多，现有技术通过过表达一个或几个酶的基因往往难以完成l-赖氨酸合成途径中的多酶种的同时增强来提高工业菌l-赖氨酸的合成强度。纤维小体可连续组装多个酶蛋白，由于胞内环境钙离子浓度低，现有技术无法实现胞内纤维小体关键元件两两组装关键酶。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于纤维小体的胞内高产l-赖氨酸工程菌构建方法及应用。

2、本发明涉及的技术方案如下：

3、一种基于纤维小体的胞内高产l-赖氨酸工程菌构建方法，包括如下步骤：

4、利用对接蛋白doca-s3和黏连蛋白coh组装两种酶基因组合，构建质粒表达载体，将质粒表达载体转化入大肠杆菌，获得大肠杆菌工程菌；

5、所述两种酶基因组合包括：aspc和lysc组合、lysc和asd组合、asd和dapa组合、dapa和dapb组合、dapb和dape组合、dape和dapf组合或dapf和lysa组合；

6、所述对接蛋白doca-s3的核苷酸序列如seq id no.1所示，氨基酸序列如seq idno.2所示；

7、所述黏连蛋白coh的核苷酸序列核苷酸序列如seq id no.3所示，氨基酸序列如seq id no.4所示；

8、酶基因aspc核苷酸序列如seq id no.5所示；

9、酶基因lysc核苷酸序列如seq id no.6所示；

10、酶基因asd核苷酸序列如seq id no.7所示；

11、酶基因dapa核苷酸序列如seq id no.8所示；

12、酶基因dapb核苷酸序列如seq id no.9所示；

13、酶基因dape核苷酸序列如seq id no.10所示；

14、酶基因dapf核苷酸序列如seq id no.11所示；

15、酶基因lysa核苷酸序列如seq id no.12所示。

16、根据本发明优选的，对接蛋白doca-s3和黏连蛋白coh组装两种酶基因组合，具体如下：

17、aspc和coh连接，lysc和doca-s3连接；

18、lysc和coh连接，asd和doca-s3连接；

19、asd和coh连接，dapa和doca-s3连接；

20、dapa和coh连接，dapb和doca-s3连接；

21、dapb和coh连接，dape和doca-s3连接；

22、dape和coh连接，dapf和doca-s3连接；

23、或dapf和coh连接，lysa和doca-s3连接。

24、根据本发明优选的，对接蛋白doca-s3和黏连蛋白coh组装两种酶基因组合为aspc和coh连接，lysc和doca-s3连接。

25、根据本发明优选的，所述大肠杆菌的保藏编号为cgmcc 1.12875。

26、根据本发明优选的，所述构建方法中，质粒表达载体的构建，按照启动子、酶基因、柔性连接肽(ggggs)3、纤维小体单元coh及终止子；启动子、酶基因、柔性连接肽(ggggs)3、纤维小体doca-s3及终止子进行基因组装合成质粒，再以合成质粒为模板进行扩增，将扩增的基因片段分别连接至pet-28a(+)载体中，获得质粒表达载体pet-28a(+)-aspc-coh/doca-s3-lysc、pet-28a(+)-lysc-coh/doca-s3-asd、pet-28a(+)-asd-coh/doca-s3-dapa、pet-28a(+)-dapa-coh/doca-s3-dapb、pet-28a(+)-dapb-coh/doca-s3-dape、pet-28a(+)-dape-coh/doca-s3-dapf或pet-28a(+)-dapf-coh/doca-s3-lysa；

27、启动子核苷酸序列如seq id no.27所示，终止子核苷酸序列如seq id no.28所示。

28、进一步优选的，所述构建方法，包括如下步骤：

29、(1)构建质粒表达载体

30、(a)以合成质粒puc57-aspc-coh/doca-s3-lysc为模板扩增aspc-coh/doca-s3-lysc基因片段；无缝克隆连接至pet-28a(+)中，获得质粒pet-28a(+)-aspc-coh/doca-s3-lysc；

31、(b)以合成质粒puc57-lysc-coh/doca-s3-asd为模板扩增lysc-coh/doca-s3-asd基因片段；无缝克隆连接至pet-28a(+)中，获得质粒pet-28a(+)-lysc-coh/doca-s3-asd；

32、(c)以合成质粒puc57-asd-coh/doca-s3-dapa为模板扩增asd-coh/doca-s3-dapa基因片段；无缝克隆连接至pet-28a(+)中，获得质粒pet-28a(+)-asd-coh/doca-s3-dapa；

33、(d)以合成质粒puc57-dapa-coh/doca-s3-dapb为模板扩增dapa-coh/doca-s3-dapb基因片段；无缝克隆连接至pet-28a(+)中，获得质粒pet-28a(+)-dapa-coh/doca-s3-dapb；

34、(e)以合成质粒puc57-dapb-coh/doca-s3-dape为模板扩增dapb-coh/doca-s3-dape基因片段；无缝克隆连接至pet-28a(+)中，获得质粒pet-28a(+)-dapb-coh/doca-s3-dape；

35、(f)以合成质粒puc57-dape-coh/doca-s3-dapf为模板扩增dape-coh/doca-s3-dapf基因片段；无缝克隆连接至pet-28a(+)中，获得质粒pet-28a(+)-da pe-coh/doca-s3-dapf；

36、(g)以合成质粒puc57-dapf-coh/doca-s3-lysa为模板扩增dapf-coh/doca-s3-lysa基因片段；无缝克隆连接至pet-28a(+)中，获得质粒pet-28a(+)-dapf-coh/doca-s3-lysa；

37、(2)将步骤(1)构建的质粒表达载体，分别转化大肠杆菌e.coli cgmcc 1.12875菌中，筛选获得大肠杆菌qde::pet-28a(+)-aspc-coh/doca-s3-lysc工程菌、qde::pet-28a(+)-lysc-coh/doca-s3-asd工程菌、qde::pet-28a(+)-asd-coh/doca-s3-dapa工程菌、qde::pet-28a(+)-dapa-coh/doca-s3-dapb工程菌、qde::pet-28a(+)-dapb-coh/doca-s3-dape工程菌、qde::pet-28a(+)-dape-coh/doca-s3-dapf工程菌或qde::pet-28a(+)-dapf-coh/doca-s3-lysa工程菌。

38、进一步优选的，所述构建方法中，酶基因扩增引物核苷酸序列如下：

39、doca-s3-f1：caggaaacagaccatgtttgagaacattaccgc seq idno.13

40、doca-s3-r1：agtaatttgtttgagtaagcggccgcact seq id no.14

41、doca-s3-f2：aaacagaccatgagcgatggcgtggtt seq id no.15

42、doca-s3-r2：tctcgttacctgctccgtgtcat seq id no.16

43、doca-s3-f3：acaggaaacagaccatgaaaaatgttgg seq id no.17

44、doca-s3-r3：acctgctccgtgtcatctaagcggccgca seq id no.18

45、doca-s3-f4：aggaaacagaccatgttcacggga seq id no.19

46、doca-s3-r4：gctccgtgtcatctaagcggccgcac seq id no.20

47、doca-s3-f5：gaccatgcatgatgcaaacatccgcg seq id no.21

48、doca-s3-r5：gctgaagcgcagcgttctgcgtgcga seq id no.22

49、doca-s3-f6：gaccatgtcgtgcccggttattgag seq id no.23

50、doca-s3-r6：ggatttattcatctataagcggccg seq id no.24

51、doca-s3-f7：cagaccatgagcgatggcgtggttgtgga seq id no.25

52、doca-s3-r7：cctgctccgtgtcatctaagcggcc seq id no.26。

53、进一步优选的，所述构建方法中，pcr反应体系：

54、质粒载体模板2μl，正向引物f 2μl，反向引物r 2μl，2×phanta max master mix25μl，ddh2o 19μl。

55、进一步优选的，所述构建方法中，pcr反应条件：

56、95℃预变性3min；95℃15sec，60℃15sec，72℃1min，35个循环；补充延伸72℃5min。

57、进一步优选的，步骤(2)中筛选方法为将转化子涂布于含有卡那霉素50μg·ml-1的lb固体培养基上，37℃过夜培养后，挑取单菌落，并进行测序验证。

58、上述方法构建的工程菌在生产l-赖氨酸中的应用。

59、本发明的有益效果如下：

60、1、本发明利用纤维小体对接蛋白突变体doca-s3实现了在细胞内与纤维小体黏连蛋白的有效组装，本发明提供的工程菌能够有效提高l-赖氨酸的产量，工程菌株产l-赖氨酸浓度达到52g/l以上，尤其是工程菌株qde::pet-28a(+)-aspc-coh/doca-s3-lysc产l-赖氨酸浓度达到60.3g/l。

61、2、本发明为细胞内多酶复合体的组装提供了新的方法和途径，具有广泛的应用前景。