一种基于MIRA检测样品中单纯疱疹病毒的试剂盒及其用途

本发明属于生物检测，涉及一种基于mira检测样品中单纯疱疹病毒的试剂盒及其用途。

背景技术：

1、 单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，hsv）感染导致皮肤、口唇或生殖器等部位出现充满液体的水疱，严重的可以引起角膜炎或脑炎，新生儿感染更可导致持久性神经功能障碍或死亡。单纯疱疹病毒感染后会延续终生，受外界刺激后引起复发，不仅给患者本人带来长期精神和身体困扰，也大幅增加医疗负担。hsv分为2个亚型，即hsv-1和hsv-2，其中hsv-1主要引起生殖器以外的皮肤黏膜感染，hsv-2主要引起生殖器部位感染，但近年来hsv-1在生殖器感染中也常被检出。

2、早发现、早诊断、早治疗是有效抵御hsv进一步感染的重要举措。目前，对hsv检测方法主要有直接涂片法、病毒分离培养法、血清学检测方法和pcr检测法等。

3、直接涂片法操作简单、费用低，但易受主观因素影响，常出现假阳性或假阴性，对检测人员技术和经验要求较高。

4、病毒分离培养法是鉴定hsv感染的金标准，但该方法受条件和技术水平限制，且费时费力、成本高、容易污染等，难以满足临床检测需求。

5、血清学检测方法中酶联免疫吸附试验（elisa）在临床上较为常见，hsv抗原检测对临床表现典型患者非常实用，但抗体产生需要窗口期，例如igm抗体在感染后10天才能检测到，导致诊断存在滞后性，诊断结果不能准确反映当前是否感染。此外，采样人为操作等也容易产生假阳性。

6、 pcr检测目前已经开发了多重pcr、巢式pcr、荧光定量pcr方法等。pcr方法的灵敏度和特异性显著高于细胞培养法，但其操作复杂、耗时，需要特殊仪器设备，且需要经验丰富的技术人员，使其不适合在资源有限的环境或现场测试中广泛使用。

7、因此，亟需一种操作简单、特异性强、灵敏度高的单纯疱疹病毒检测方法。

8、 多酶恒温快速扩增（multi-enzyme isothermal rapid amplification，mira）是一种基于常温的恒温核酸快速扩增技术，该技术对样本及实验室环境要求较低，可以在短时间内将少量核酸扩增至可检测出水平，结合侧流层析试纸条（lateral flow dipstick，lfd）形成mira-lfd快速诊断方法，能够对结果实现可视化读取。mira-lfd方法具有操作简单、快速、灵敏、特异性强，不需要特殊仪器等优点，适合于快速检测，适用于临床样品检测。

技术实现思路

1、本发明的首要目的是提供一种基于mira检测样品中单纯疱疹病毒的试剂盒，以能够操作简单、特异性强、灵敏度高的进行样品中单纯疱疹病毒的检测。

2、为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种基于mira检测样品中单纯疱疹病毒的试剂盒，所述的试剂盒包括用于mira扩增的引物对和探针，

3、所述的引物对由正向引物和反向引物组成，其中正向引物的序列为：tcaccgggacgaccacgagaccgacatggagct，反向引物的序列为： gcgacccctcccggtagccgtaaaacggggaca；

4、所述的探针的序列为：

5、tggcacaccaccgacctcaagtacaacccctcgcgggtggaggcgttcca。

6、本发明的相关原理如下：

7、2006 年niall armes（英国剑桥，wellcome trust sanger institute创立的asmscientific ltd）首次推出重组酶聚合酶扩增技术rpa。该方法的原理是：重组酶与引物结合形成的蛋白-dna复合物，能在双链dna中寻找同源序列，一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动dna合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增；被替换的dna链与单链结合蛋白（single strand dna-binding protein，ssb）结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件，整个过程进行得非常快，一般可在10分钟之内获得可检出水平的扩增产物。

8、该方法主要依赖于三种蛋白：能结合单链核酸（寡核苷酸引物）的重组酶、单链dna结合蛋白和链置换dna聚合酶。这三种蛋白的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37°c左右。

9、总之，该方法不是通过加热，而是通过一种酶实现dna双链的分离，且该方法可以在恒定温度下、短时间内产生数十亿个dna拷贝。

10、目前，在rpa扩增的基础上，研究人员已经开发出了基于荧光型rpa、rpa结合侧流层析试纸（rpa-lfd）等多种类型扩增检测技术。其中，rpa-lfd方法为rpa扩增结束后，将扩增产物添加至含胶体金侧流层析试纸条中，可在数分钟内用肉眼观察结果。潍坊安普未来生物科技有限公司也开发出了一套类似于rpa的多酶反应体系，被称为mira-lfd。

11、 mira是在rpa基础上开发出的重组酶聚合酶扩增技术。在mira的基础上已经发展出mira电泳、mira结合免疫荧光实时监测、mira结合侧流层析试纸条扩增技术，三者均是基于多酶恒温扩增的方法，实现模板指数级扩增，但在引物、探针设计及结果呈现形式上有所差异。

12、普通mira只需要使用合适的正反向引物即可；而荧光实时监测和侧流层析，则需要设计独特的引物和探针，应用这些探针在很大程度上减少了扩增中的非特异性信号，提高了测定的特异性和灵敏度。

13、普通mira可以通过类似于pcr产物检测的方法直接电泳进行观察；荧光实时监测法在通过荧光定量pcr仪扩增后，通过扩增曲线判断结果；而侧流层析则通过胶体金检测试剂卡的形式直观的判断结果。因此操作简易性：侧流层析法>荧光实时监测法>电泳法；检测时间：电泳法>荧光实时监测法>侧流层析法；检测成本：电泳法>侧流层析法>荧光实时监测法。

14、 mira-lfd扩增检测体系包含标记的引物和探针、多聚酶等，其原理为（参见图1，并参见： 1、qinzheng z,ya l,zheng w, et al. rapid on-site detection of thebursaphelenchus xylophilus using recombinase polymerase amplificationcombined with lateral flow dipstick that eliminates interference from primer-dependent artifacts [j]. frontiers in plant science,2022,13. 2、li j,macdonaldj. advances in isothermal amplification: novel strategies inspired bybiological processes[j]. biosensors and bioelectronics,2015,64.）：

15、（1）mira反应：设计用于rpa-lfd反应的特殊引物，反向引物5’端带有生物素标记。探针5’端带有fam标签，3’端带有c3-spacer，中间带有四氢呋喃（thf）间隔区用于核酸内切酶（nfo）识别。重组酶和引物形成蛋白/单链核苷酸复合体rec/ss-dna，在目标核酸上扫描寻找互补序列，找到后即可开始链置换反应，在辅助蛋白和单链结合蛋白的帮助下，侵入双链dna模板；在侵入位点形成d-loop区域，并开始对dna双链进行扫描；待找到与引物互补的目的区域后，复合体rec/ssdna解体的同时，聚合酶也结合到引物的3′末端，开始链的延伸，依nfo的作用，加入根据模板设计的特异性分子探针在20min内扩增目标核酸。反应结束后，产生带有fam和生物素标记的扩增产物。

16、 （2）侧流层析试纸检测：扩增产物加入样品孔，fam标记的扩增产物与结合区中fam抗体结合，被毛细管力驱动移动穿过缀合物垫并结合到抗fam-aunp，继续流动至检测线（t线）时，生物素标记的扩增产物被t线中链霉亲和素捕获，二者结合后大量胶体金聚集，形成红色条带。

17、在一种优选的实施方案中，本发明提供一种基于mira检测样品中单纯疱疹病毒的试剂盒，其中所述的反向引物为5’端生物素标记的反向引物。

18、在一种优选的实施方案中，本发明提供一种基于mira检测样品中单纯疱疹病毒的试剂盒，其中所述的探针在5’端用fam标记，3’端用spc3标记，且33和35nt之间的碱基c用thf进行替换。

19、 在一种优选的实施方案中，本发明提供一种基于mira检测样品中单纯疱疹病毒的试剂盒，其中所述的试剂盒构成的mira扩增反应体系为：29.4 μl a buffer，2 μl 10μm正向引物、2μl 10μm反向引物，0.6 μl 10μm探针，12.5 μl ddh2o，1 μl dna模板，2.5 μl bbuffer。

20、在一种优选的实施方案中，本发明提供一种基于mira检测样品中单纯疱疹病毒的试剂盒，其中所述的单纯疱疹病毒为hsv-1和/或hsv-2。

21、在一种优选的实施方案中，本发明提供一种基于mira检测样品中单纯疱疹病毒的试剂盒，其中所述的试剂盒还包括配套检测mira扩增产物的核酸检测试纸条。

22、在一种优选的实施方案中，本发明提供一种基于mira检测样品中单纯疱疹病毒的试剂盒，其中所述的核酸检测试纸条为侧流层析试纸条。

23、在一种优选的实施方案中，本发明提供一种基于mira检测样品中单纯疱疹病毒的试剂盒，其中所述的侧流层析试纸条包括fam抗体。

24、在一种优选的实施方案中，本发明提供一种基于mira检测样品中单纯疱疹病毒的试剂盒，其中所述的侧流层析试纸条为胶体金侧流层析试纸条。

25、本发明的第二个目的是提供如上所述的试剂盒用于检测样品中是否存在单纯疱疹病毒的用途，以能够操作简单、特异性强、灵敏度高的进行样品中单纯疱疹病毒的检测。

26、为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供如上所述的试剂盒用于检测样品中是否存在单纯疱疹病毒的用途，所述的用途为非诊断目的。

27、本发明的有益效果在于，利用本发明的基于mira检测样品中单纯疱疹病毒的试剂盒及其用途，能够操作简单、特异性强、灵敏度高的进行样品中单纯疱疹病毒的检测。

28、本发明的试剂盒可方便快捷、短时间内同时检测2种亚型hsv，且不需要昂贵的仪器设备；检测灵敏度高，最低可检测出100基因组拷贝/µl；检测特异性好，与hsv同科病毒无交叉反应。

29、本发明的试剂盒对于单纯疱疹病毒感染的诊断与临床用药指导具有较高的参考价值，适于推广应用。