用于合成核苷酸链的组合物以及核苷酸链的合成方法与流程

本技术涉及核苷酸合成，具体而言，涉及一种用于合成核苷酸链的组合物以及核苷酸链的合成方法。

背景技术：

1、目前，核苷酸链的合成一般都是通过将核苷酸残基以每次1个碱基依次串联延伸合成来制备目标核苷酸链。由于核苷酸链的化学合成反应的效率无法达到100％，所以，合成的目标核苷酸链的产物纯度和目标产物的收量，均会随着目标核苷酸链的长度的增加而下降，导致合成产物中含有一定量的长度与目标核苷酸链不符的非目标核苷酸链。

2、对于长度小于或等于20mer的核苷酸链，其化合合成后，可通过纯化工艺(例如，离子柱或反向柱等)提高最终目标核苷酸链在合成产物中的占比；但是，由于部分非目标核苷酸链的长度与目标核苷酸链的长度较为接近(例如，非目标核苷酸链的长度仅与目标核苷酸链的长度相差1mer或2mer)，这些非目标核苷酸链与目标核苷酸链的性质极为接近，导致这些非目标核苷酸链无法有效从合成产物中分离去除。而对于长度大于20mer的核苷酸链，特别是长度大于50mer的核苷酸链，甚至是长度大于100mer的核苷酸链，其化学合成后，会导致更多的非目标核苷酸链均无法有效从合成产物中分离去除。

3、而合成产物中非目标核苷酸链的存在往往会影响目标核苷酸链的功能和活性等，特别是对于目标核苷酸链为反义链药物、rnai药物、核酸适配体药物以及sgrna药物等，非目标核苷酸链的存在会严重影响目标核苷酸链发挥其功效。

技术实现思路

1、本技术的目的在于提供一种用于合成核苷酸链的组合物以及核苷酸链的合成方法，其能够降低核苷酸链的合成产物中非目标核苷酸链的含量，以提高合成产物中目标核苷酸链的纯度。

2、第一方面，本技术提供了一种用于合成核苷酸链的组合物，该组合物包括：核苷酸片段以及双链连接酶；其中，核苷酸片段用于形成双链结构；双链连接酶为可封闭双链结构中的缺口的连接酶；且双链结构中的至少一条链为目标核苷酸链；核苷酸片段包括第一片段和第二片段；第一片段的5’端含有单磷酸基团，且第一片段采用3’至5’方向合成；第二片段的3’端含有羟基基团，且第二片段采用5’至3’方向合成。

3、本技术提供的用于合成核苷酸链的组合物中，核苷酸片段具有采用3’至5’方向合成且5’端含有单磷酸基团的第一片段，以及采用5’至3’方向合成且3’端含有羟基基团的第二片段，第一片段和第二片段可以相互配合并共同形成双链结构，可大幅降低核苷酸链的合成产物中非目标核苷酸链的含量，以有效提高合成产物中目标核苷酸链的纯度，进而有利于充分发挥目标核苷酸链的功效。

4、结合第一方面，在本技术可选的实施方式中，核苷酸片段还包括第三片段，第三片段的3’端含有羟基基团，第三片段的5’端含有单磷酸基团。

5、可选地，第三片段采用3’至5’方向合成，或，第三片段采用5’至3’方向合成。

6、结合第一方面，在本技术可选的实施方式中，用于合成核苷酸链的组合物还包括模板链，模板链与核苷酸片段用于共同形成双链结构；且核苷酸片段用于形成目标核苷酸链。

7、结合第一方面，在本技术可选的实施方式中，模板链为直链结构；模板链可与第一片段的5’端的序列反向互补，形成第一互补区域；模板链可与第二片段的3’端的序列反向互补，形成第二互补区域；第一片段的5’端可与第二片段的3’端之间形成缺口。

8、在上述技术方案中，模板链可与核苷酸片段共同形成双链结构，且核苷酸片段可形成目标核苷酸链。

9、结合第一方面，在本技术可选的实施方式中，模板链为发夹结构；模板链可与第一片段的5’端的序列反向互补，形成第一互补区域；模板链可与第二片段的3’端的序列反向互补，形成第二互补区域。模板链的5’端含有单磷酸基团，且模板链的5’端可与第一片段的3’端之间形成缺口；或，模板链的3’端含有羟基基团，且模板链的3’端可与第二片段的5’端之间形成缺口。

10、在上述技术方案中，模板链可与核苷酸片段共同形成双链结构，且核苷酸片段可形成目标核苷酸链。

11、结合第一方面，在本技术可选的实施方式中，第一片段为发夹结构；第一片段可与第二片段的3’端的序列反向互补，且第一片段的5’端可与第二片段的3’端之间形成缺口；第一片段以及第二片段连接后的核苷酸链为目标核苷酸链。或，第二片段为发夹结构；第二片段可与第一片段的5’端的序列反向互补，且第二片段的3’端可与第一片段的5’端之间形成缺口；第一片段以及第二片段连接后的核苷酸链为目标核苷酸链。

12、在上述技术方案中，第一片段可与第二片段共同形成双链结构，且第一片段以及第二片段连接后可形成目标核苷酸链。

13、结合第一方面，在本技术可选的实施方式中，模板链具有至少两个模板片段，模板片段为直链结构，且至少两个模板片段之间可形成缺口；模板链可与第一片段的5’端的序列反向互补，形成第一互补区域；模板链可与第二片段的3’端的序列反向互补，形成第二互补区域；第一片段的5’端可与第二片段的3’端之间形成缺口；且核苷酸片段用于形成目标核苷酸链。

14、在上述技术方案中，模板链可与核苷酸片段共同形成双链结构，核苷酸片段可形成目标核苷酸链。

15、可选地，模板片段中包括一个第四片段以及一个第五片段；第四片段的5’端含有单磷酸基团，且第四片段采用3’至5’方向合成；第五片段的3’端含有羟基基团，且第五片段采用5’至3’方向合成；第四片段的5’端与第五片段的3’端之间形成缺口；第一片段的5’端与第二片段的3’端之间形成缺口。

16、结合第一方面，在本技术可选的实施方式中，核苷酸片段还包括第六片段以及第七片段；第六片段的5’端含有单磷酸基团，且第六片段采用3’至5’方向合成；第七片段的3’端含有羟基基团，且第七片段采用5’至3’方向合成。第六片段的5’端与第七片段的3’端之间形成缺口，且第六片段以及第七片段共同形成第一目标核苷酸链。第一片段的5’端与第二片段的3’端之间形成缺口，且第一片段以及第二片段共同形成第二目标核苷酸链。第一目标核苷酸链以及第二目标核苷酸链用于共同形成双链结构。

17、在上述技术方案中，第六片段以及第七片段共同形成第一目标核苷酸链，第一片段以及第二片段可共同形成第二目标核苷酸链，可进一步有效降低核苷酸链的合成产物中非目标核苷酸链的含量，以进一步有效提高合成产物中目标核苷酸链的纯度，进而有利于充分发挥目标核苷酸链的功效。

18、结合第一方面，在本技术可选的实施方式中，核苷酸片段还包括第六片段以及第七片段；第六片段的5’端含有单磷酸基团，且第六片段采用3’至5’方向合成；第七片段的3’端含有羟基基团，且第七片段采用5’至3’方向合成。第六片段的5’端与第七片段的3’端之间形成缺口，且第六片段以及第七片段共同形成第一目标核苷酸链；第三片段的3’端与第一片段的5’端之间形成缺口，第三片段的5’端与第二片段的3’端之间形成缺口；且第一片段、第三片段以及第二片段用于共同形成第二目标核苷酸链。第一目标核苷酸链以及第二目标核苷酸链用于共同形成双链结构。

19、在上述技术方案中，第六片段以及第七片段共同形成第一目标核苷酸链，第一片段、第三片段以及第二片段可共同形成第二目标核苷酸链，可进一步有效降低核苷酸链的合成产物中非目标核苷酸链的含量，以进一步有效提高合成产物中目标核苷酸链的纯度，进而有利于充分发挥目标核苷酸链的功效。

20、结合第一方面，在本技术可选的实施方式中，当核苷酸片段为dna时，双链连接酶为dna双链连接酶；dna双链连接酶包括t4 dna连接酶；当核苷酸片段为rna时，双链连接酶为rna双链连接酶；rna双链连接酶包括rnl2家族连接酶以及rnl5家族连接酶。或/和，核苷酸片段含有4～200个碱基。或/和，用于合成核苷酸链的组合物还包括含有镁离子的缓冲液。

21、可选地，核苷酸片段含有4～120个碱基。

22、结合第一方面，在本技术可选的实施方式中，核苷酸片段含有或不含有修饰基团；或/和，模板链含有或不含有修饰基团。

23、结合第一方面，在本技术可选的实施方式中，模板链的制备方法包括：按照模板链的目标序列进行合成模板链的反应，然后不对合成产物进行纯化处理；或/和，核苷酸片段的制备方法包括：按照核苷酸片段的目标序列进行合成核苷酸片段的反应，然后不对合成产物进行纯化处理。

24、在上述技术方案中，模板链和核苷酸片段合成后即使不进行纯化处理，也可实现大幅降低核苷酸链的合成产物中非目标核苷酸链的含量，以有效提高合成产物中目标核苷酸链的纯度，进而有利于充分发挥目标核苷酸链的功效。

25、第二方面，本技术提供了一种核苷酸链的合成方法，该合成方法包括：采用如上述第一方面任一项提供的用于合成核苷酸链的组合物进行核苷酸链的合成反应。

26、本技术提供的核苷酸链的合成方法，由于合成原料中具有采用3’至5’方向合成且5’端含有单磷酸基团的第一片段，以及采用5’至3’方向合成且3’端含有羟基基团的第二片段，第一片段和第二片段可以相互配合并共同形成双链结构，可大幅降低核苷酸链的合成产物中非目标核苷酸链的含量，以有效提高合成产物中目标核苷酸链的纯度，进而有利于充分发挥目标核苷酸链的功效。