一种利用沉默基因靶点生物控蚊的方法

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种利用沉默基因靶点生物控蚊的方法。

背景技术：

1、蚊媒传染病是全世界重视的公共卫生问题，每年高达72万人死于这种传染病。其中最常见的几种蚊媒病毒源于黄病毒科黄病毒属，分别是登革热病毒(dengue virus，denv)、寨卡病毒(zika virus，zikv)和黄热病毒(yellow fever，yfv)，以及甲病毒属的基孔肯雅病毒(chikungunya virus，chikv)。其中黄热病每年大约造成30000人死亡，而登革热每年威胁着约39.7亿人的生命健康。以上四种疾病的传播媒介均为白纹伊蚊，因此全球针对此类蚊媒病毒的防疫重点集中在对伊蚊的限制手段上。

2、拟菊酯类杀虫剂和有机磷酸酯类杀虫剂的使用是最常用的控蚊手段，但高额的成本和蚊虫耐药性的增强也逐渐暴露出其不足之处，因此需要一种新型的蚊媒干预措施。无菌昆虫技术(sit)和wolbachia感染雄蚊技术是比较先进的生物控蚊手段，但是前者实验中的辐射会造成部分雄性伊蚊交配能力低下，而后者实验中部分非目标节肢昆虫也受到wolbachia菌株的感染，具有对生物和生态安全威胁的隐患。因此两项技术仍需完善。

3、rna干扰是细胞生物学中应用最广泛的工具之一，可以通过双链rna(dsrna)触发目标基因的沉默效应。而rnai基因片段传递入生物体方式的分为非微生物介导和微生物介导两类。非微生物介导rnai包括注射法、浸泡法和纳米颗粒介导法，而微生物介导包括细菌介导法、酵母介导法以及微藻介导法。微藻是一个由单细胞真核生物组成的多系群，生活在水生和陆地环境，且可进行光合自养，异养以及混合营养。在自然界中，部分种类微藻由于体积小且富含营养，被伊蚊幼虫当做食物来源。

4、本发明将cyp15a1、famet、jhamt基因作为rnai靶点构建表达载体，可用于伊蚊的生物控制，具有环境友好的特色和较高的商业应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种利用沉默基因靶点生物控蚊的方法。

2、本发明的第一个方面是一种双链rna，所述双链rna为cyp15a1 rna、famet rna或jhamt rna；编码cyp15a1 rna的正义链核苷酸序列为序列表中seq id no.1所示序列，反义链核苷酸序列为序列表中seq id no.2所示序列；编码famet rna的正义链核苷酸序列为序列表中seq id no.3所示序列，反义链核苷酸序列为序列表中seq id no.4所示序列；编码jhamt rna的正义链核苷酸序列为序列表中seq id no.5所示序列，反义链核苷酸序列为序列表中seq id no.6所示序列。

3、本发明的第二个方面是提供一种编码本发明第一个方面所述双链rna的双链dna，所述双链dna编码区包括正义链和反义链；编码cyp15a1 rna的正义链核苷酸序列为序列表中seq id no.1所示序列，反义链核苷酸序列为序列表中seq id no.2所示序列；编码fametrna的正义链核苷酸序列为序列表中seq id no.3所示序列，反义链核苷酸序列为序列表中seq id no.4所示序列；编码jhamt rna的正义链核苷酸序列为序列表中seq id no.5所示序列，反义链核苷酸序列为序列表中seq id no.6所示序列。

4、本发明的第三个方面是提供一种表达载体，其含有接受载体、供给载体和编码本发明第一个方面所述的双链rna的序列。

5、所述接受载体是多基因组装过程中接受和承载外源基因片段的载体，可以采用多基因组装过程中常用的接受载体，本发明对此不作特别限定。在本发明的一个具体的实施方式中，所述接受载体采用pmaa7ir/xir，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒等。

6、所述供给载体是多基因组装过程中将目的基因往接受载体输送的载体，可以采用多基因组装过程中常用的供给载体，本发明对此不作特别限定。在本发明的一个具体的实施方式中，所述接受载体采用pt282，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒等。

7、优选地，所述接受载体为pmaa7ir/xir，所述供给载体为pt282，正义链位于pt282载体的hind iii和bam hi两限制性内切酶位点之间，反义链位于pt282载体的xba i和sali两限制性内切酶位点之间，所述接受载体与所述供给载体通过ecorⅰ酶切连接。

8、本发明的第四个方面是提供一种转基因微藻，其由本发明第二个方面所述的表达载体转化微藻制备而成，且所述微藻为蚊子幼虫可食用的微藻。

9、优选地，所述微藻为衣藻(例如莱茵衣藻等)、小球藻(例如核蛋白小球藻、普通小球藻等)、栅藻或团藻等。

10、本发明的第五个方面是提供本发明第一个方面所述的双链rna、或者本发明第二个方面所述的双链dna，或者本发明第三个方面所述的表达载体、或者本发明第四个方面所述的转基因微藻在沉默基因中的应用，其中cyp15a1 rna沉默cyp15a1基因、famet rna沉默famet基因，jhamtrna沉默jhamtrna基因。

11、所述cyp15a1基因为伊蚊cyp15a1基因(genbank登录号：aael022200-ra)或与伊蚊cyp15a1基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的dna序列；

12、所述famet基因为伊蚊famet基因(genbank登录号：loc5568940)或与伊蚊famet基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的dna序列；

13、所述jhamt基因为伊蚊jhamt基因(genbank登录号：loc5567710)或与伊蚊jhamt基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的dna序列。

14、本发明的第六个方面是提供本发明第一个方面所述的双链rna、或者本发明第二个方面所述的双链dna，或者本发明第三个方面所述的表达载体、或者本发明第四个方面所述的转基因微藻在制备防控伊蚊的试剂中的应用。

15、本发明的第七个方面是提供本发明第一个方面所述的双链rna、或者本发明第二个方面所述的双链dna，或者本发明第三个方面所述的表达载体、或者本发明第四个方面所述的转基因微藻在制备抑制伊蚊幼虫生长的试剂中的应用。

16、所述试剂能够有效减少伊蚊幼虫体长。

17、本发明的第八个方面是提供本发明第一个方面所述的双链rna、或者本发明第二个方面所述的双链dna，或者本发明第三个方面所述的表达载体、或者本发明第四个方面所述的转基因微藻在制备提高伊蚊幼虫体内的过氧化物酶、和/或超氧化物歧化酶、和/或过氧化氢酶的活性的试剂中的应用。

18、本发明的第九个方面是提供一种利用沉默基因靶点生物控蚊的方法，采用第四个方面所述的转基因微藻喂食伊蚊幼虫。

19、本发明提供的双链rna以及含有编码该双链rna的序列的表达载体能有效沉默cyp15a1、famet或jhamt基因，减少伊蚊幼虫体长，提高伊蚊体内抗氧化酶活性，可用于伊蚊的生物控制，具有环境友好的特色和较高的商业应用价值，例如具体实施方式中将含有编码本发明双链rna的序列的表达载体转化微藻核基因组，获得工程藻株，喂养伊蚊幼虫，能够有效沉默靶基因，减少伊蚊幼虫体长，提高伊蚊体内抗氧化酶活性，并使伊蚊幼虫致死。