一种抗TNF-α纳米抗体及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药，具体涉及一种抗tnf-α纳米抗体及其应用。

背景技术：

1、tnf-α即肿瘤坏死因子α，也被称作cachectin和tnfsf1a，是tnf超家族的配体。它是一种多效细胞分子，在炎症、细胞凋亡和免疫系统发育中起着核心作用。tnf-α由巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞、cd4+t细胞、nk细胞分泌，属于促炎细胞因子，参与正常炎症反应和免疫反应，可以协同调节其它细胞因子的产生、细胞存活和死亡来协调组织的稳态。tnf-α存在两种生物活性形式：跨膜形(tmtnf-α)和分泌形(stnf-α)，它在许多病理状态下表达增多，包括恶性肿瘤、慢性炎性疾病、败血症等。tnf-α可以由肿瘤相关微环境中的恶性细胞和免疫细胞产生，其作为内源性肿瘤启动子，通过产生炎症生态环境来促进恶性疾病的进展。tnf-α对各种肿瘤细胞有细胞毒性，是介导细菌感染的免疫应答的一个重要因素，在感染性休克、自身免疫疾病、风湿性关节炎、炎症和糖尿病也扮演了重要的角色，因此，tnf-α成为重要的药物靶点，亟需一种高亲和力的抗体治疗tnf-α相关的疾病。

2、纳米抗体，是1989年从羊驼外周血液中发现的一种天然缺失轻链的抗体。纳米抗体由于轻链缺失，只包含一个重链可变区(vhh)和两个常规的ch2和ch3区，也被称为重链单域抗体。纳米抗体因其体积和分子量小，具有良好的组织穿透性，可以穿透屏障到达病灶组织，且以排出，半衰期短，极大地避免了毒性作用。因此，可将纳米抗体应用于结合tnf-α，从而治疗tnf-α相关的疾病。然而，目前缺乏与tnf-α高亲和力的纳米抗体。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种抗tnf-α纳米抗体及其应用。

2、本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种抗tnf-α纳米抗体，该纳米抗体为tn-15、tn-24、tn-27、tn-28、tn-70；

3、tn-15的vhh区的氨基酸序列如下所示：

4、evqlvesggglvqpggslrlscvasgfttsrycmgwfrqapgkeregvaiidtdg gtnhadsvkgrftisldnarntlylqmnglepedtamyycaavffrrrglcsaymsa mdywgqgtqvtvss(seq id no：20)；

5、tn-24的vhh区的氨基酸序列如下所示：

6、qvklvesgggsvqaggslrlscaasgytyssycmgwfrkapgkpregvaqinsd gstsyvdsvkgrftisqdnakntlylqmnslkpedtamyycaadplrswcsgtvllt qnyrnwgqgtqvtvss(seq id no：1)；

7、tn-27的vhh区的氨基酸序列如下所示：

8、evqlvesgggsvqpggslrlsctasgftsdnsdmgwyreapgnecklvssitsdgi tyysdsvrgrftisqdnakntvylqmnslkpedtavyycaaphlgmkvlgvvgicra peynywgqgtqvtvss(seq id no：17)；

9、tn-28的vhh区的氨基酸序列如下所示：

10、qvqlvesgggsvqpggslklscvasgfifsdyemnwirqapgkglewvstistsg rttfyhssvkgrftisrdnakntvylqmnnlksedtalyycafgrtggtlcvdddda ctrgqgtqvtvss(seq id no：5)；

11、tn-70的vhh区的氨基酸序列如下所示：

12、qvklvesgggsvqaggslrlscasshmwycmgwfrqapgkeregvaridrdgt tsyadsvkarftisrdnakntlnlqmnslkpedtamyycaadycrdglgldrsgyk ywgqgtqvtvss(seq id no：16)。

13、编码上述抗tnf-α纳米抗体的基因，其核苷酸序列具体为：

14、编码tn-15的基因，其核苷酸序列为：

15、gaagtgcagctcgtggagtctgggggaggcttggtgcagcctggggggtctctgagactctcctgtgtagcctctggatttaccaccagtagatactgcatgggctggttccgccaggctccagggaaggagcgcgagggggtcgcgattattgatactgatggtggtacaaaccacgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccctagacaacgcccgtaacactctgtatctgcaaatgaacgggctggaacctgaggacactgccatgtactactgtgcggcagtgttttttcgtcgccgtggtttgtgttccgcatatatgtccgccatggactactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca(seq id no：40)；

16、编码tn-24的基因，其核苷酸序列为：

17、caagtaaaactcgtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcctgtgcagcctctggatacacctacagtagctactgcatgggctggttccgcaaggctccagggaagccgcgcgagggggtcgcacaaatcaatagtgatggcagcacaagttacgtagactccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacgccaagaacactctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcggcagatcccctccggtcgtggtgctcgggtaccgtactactcactcagaactatcgcaactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca(seq id no：21)；

18、编码tn-27的基因，其核苷酸序列为：

19、gaggtgcagctcgtggagtctgggggaggctcggtgcagcctggagggtctctgagactctcctgtacagcctctggattcacttctgataattctgacatgggctggtatcgcgaggctccagggaatgagtgcaagttggtctcaagtattacgagtgatggtattacatactattcagactccgtgaggggccgattcaccatctcccaagacaacgccaagaacacggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaagacacggccgtgtattactgtgcggcccctcatctgggtatgaaggttcttggtgtagtcggaatctgtagggccccagagtataactactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca(seq id no：37)；

20、编码tn-28的基因，其核苷酸序列为：

21、caggtacagctcgtggagtctgggggaggctcggtgcagcctggggggtctctgaaactctcctgtgtagcctctggattcatcttcagtgactatgagatgaactggatccgccaggctccaggaaaggggctggagtgggtgtccaccatttcgacaagcggtagaactacattctatcacagctccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacacggtgtatctgcaaatgaacaacctgaaatctgaggacacggccctatattactgtgcgtttgggcgtactgggggtacattgtgtgttgacgatgacgatgcctgtacaaggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca(seq id no：25)；

22、编码tn-70的基因，其核苷酸序列为：

23、caagtgaaactcgtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcctgtgcaagttctcacatgtggtactgcatgggctggttccgccaggctccggggaaggagcgcgagggggtcgcacgtattgatagagatggaaccacaagctacgcagactccgtgaaggcccgattcaccatctcccgggacaacgccaagaacactcttaatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgcgcggcagattattgccgcgacggacttggtctcgacagaagcgggtataagtactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca(seq idno：36)。

24、一种表达载体，该表达载体包含上述编码抗tnf-α纳米抗体的基因。

25、一种重组细胞，该细胞包含上述表达载体。

26、上述抗tnf-α纳米抗体在制备预防和/或治疗tnf-α相关疾病的药物中的应用。

27、进一步地，tnf-α相关疾病为炎症性肠病、风湿性关节炎、感染性休克、自身免疫疾病、糖尿病、银屑病、强直性脊椎炎、银屑病关节炎、葡萄膜炎。

28、本发明具有以下有益效果：

29、本发明提供了一种抗tnf-α的纳米抗体，该纳米抗体为tn-15、tn-24、tn-27、tn-28、tn-70，其氨基酸序列分别如seq id no：20、seq id no：1、seq id no：17、seq id no：5和seq id no：16所示。本发明利用噬菌体展示文库筛选得到能够与tnf-α高亲和性结合的纳米抗体。本发明筛选得到的抗tnf-α的纳米抗体高亲和性结合tnf-α，可用于制备治疗tnf-α相关疾病的药物，为治疗这类疾病提供了新手段。