一种IRS1基因位点突变检测试剂在制备2型糖尿病预测评价试剂盒中应用方法

本发明属于基因位点突变检测应用，具体地说，涉及一种irs1基因位点突变检测试剂在制备2型糖尿病预测评价试剂盒中应用方法。

背景技术：

1、胰岛素受体底物-1(irs1)是胰岛素信号通路中的关键元件，据报道，irs1基因的突变在决定2型糖尿病相关性状的易感性中发挥作用。研究发现它可以通过与胰岛素受体结合而被磷酸化激活，从而促进机体对葡萄糖的摄取和利用，调节血糖水平。除了胰岛素信号通路外，irs1还报道参与调控机体的细胞生长、代谢和凋亡等多个细胞学过程。它的异常表达或功能发生改变可能参与多种疾病的发生、发展，如2型糖尿病、肥胖、心血管疾病等，因此，irs1也成了医学研究中的热点目标之一。

2、irs1基因位于人类染色体2号的q36.1位置，该基因cds含3729碱基，编码长度为1242个氨基酸的蛋白质。在不同的细胞类型和条件下，irs1基因可能会产生多个不同的转录本，它们的长度分别为：版本1为9771个碱基(nm_005544.3)；版本2为6777个碱基(xm_047444223.1)；版本3为6997个碱基(xm_047444224.1)。这些转录本可能具有不同的启动子、剪接方式和调节元件，并且可能在不同的组织中具有不同的表达模式。irs1 rs2943656是此基因中的一个单核苷酸多态性(snp)位点，常见a>g突变，这个snp位于irs1的调控区(启动子)内。转录因子结合位点的研究预测rs2943656等位基因g破坏了干扰素调节因子1和原癌基因myb(一种转录因子)的结合motif，并产生v-myb(骨髓母细胞增多症病毒癌基因同源物)的结合motif。表达数量性状位点分析显示rs2943656的基因型与irs1的表达有一定相关性，其中g/g基因型在皮下和网膜脂肪组织中的表达最低，表明该多态性影响骨骼肌中的irs1基因表达。在健康个体中，先前的一项研究报道，irs1 rs2943656a>g的频率增加与bmi和脂肪数量降低有关。

3、有鉴于此特提出本发明。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：

2、一种irs1基因位点突变检测试剂在制备2型糖尿病预测评价试剂盒中应用方法，包括以下工作步骤：

3、第一步：ddpcr体系配制；

4、收到样本和测试信息后，首先核对样本的名称与测试信息是否一致，无误后再开始实验，本次实验样本编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，检测位点为rs2943656，a>g；

5、

6、第二步：制备油包水微液滴；

7、第三步：聚合酶链式反应扩增；

8、第四步：微滴式数字pcr仪荧光数据读取，整理实验数据和制备实验结果图。

9、作为本发明的一种优选实施方式，所述第一步还包括：irs1 rs2943656a>g突变区域扩增引物的序列如下：

10、irs1 rs2943656a>g f向引物；attgctttcacctaaaattctcctcta

11、irs1 rs2943656a>g r向引物；gtcttggcagccatctctctct

12、用于检测的杂交荧光探针序列如下：

13、irs1 rs2943656a>g突变型探针：aaacaaaggttgaagcc

14、irs1 rs2943656a>g野生型探针：aaacaaaagttgaagcca。

15、作为本发明的一种优选实施方式，所述第一步中还包括：所述试剂盒包括微滴式数字pcr用反应预混液、热启动taq酶、sdh2o；其中，反应混合物包括：mgcl27.5mm，tris-hclbuffer 125mm，kcl 125mm，dntps 7.5mm，bsa 2mg/ml。

16、作为本发明的一种优选实施方式，所述dna用qubit3.0定量，按照测试信息用无核酶水稀释至指定浓度；取出反应预混液(微滴式数字pcr用反应预混液)，室温放置2分钟；准备样本制备通用耗材，可穿刺热封膜；在8连管中配制pcr反应体系，反应终浓度引物/探针900nm/500nm；通过旋涡振荡混匀pcr反应混合液，用离心机快速离心，以确保所有成分都在反应管的底部，让反应管在室温下静置3分钟。

17、作为本发明的一种优选实施方式，所述第二步还具体的包括：

18、a、将微滴生成芯片置于芯片卡座中，向油相孔加入50μl微滴生成油，向样本孔中加入20μl已加入模板的pcr反应混合液，然后在各样本孔水相上方加入密封剂，待油相和水相加入完成后，盖上微滴生成芯片密封垫；

19、b、将微滴生成仪和气泵打开，仪器自检完成后，气压泵数值为0.2mpa；轻按红色按钮打开仓门，将微滴生成芯片放入微滴生成仪，长按红色按钮，开始生成微滴；

20、c、待微滴生成后，依次小心将生成的微滴转移至pcr反应板中；

21、d、打开封膜仪，设置一定的封膜仪温度和封膜时间，待温度达标点击开门按钮，打开仓门将96孔板放入底座，盖上可穿刺热封膜，点击关门，点击封膜；封好膜之后进行pcr扩增；

22、e、打开pcr仪，设置pcr仪程序，将封膜完成的96孔板放入，盖上热盖，扭紧热盖上的旋钮，点击运行；

23、f、pcr结束前打开微滴检测仪，打开分析软件，点击清洗，若两天以上未用需点击灌洗；

24、g、清洗结束后在界面左侧录入信息包括样本名称，检测位点名称；

25、h、完成后轻按微滴检测仪的红色按钮，打开仓门，取下底座上的盖板，取出pcr结束的样本放入录入信息对应的孔位，压紧盖板，轻按微滴检测仪的红色按钮，关上仓门，点击微滴检测仪的分析软件界面上的运行，等待结果分析完成。

26、作为本发明的一种优选实施方式，所述c中，微滴为45-55μl。

27、作为本发明的一种优选实施方式，所述a中，在各样本孔水相上方加入5μl密封剂。

28、作为本发明的一种优选实施方式，所述f中，pcr结束前10min打开微滴检测仪。

29、作为本发明的一种优选实施方式，所述d中，封好膜之后应于30分钟内进行pcr扩增。

30、作为本发明的一种优选实施方式，所述d中，设置封膜仪温度为190℃，封膜时间为5s。

31、本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

32、本发明通过pcr体系配制、制备微滴和最后的整理实验数据和制备实验结果图，实现了irs1基因位点突变检测试剂在制备2型糖尿病预测评价试剂盒中的应用，通过统计数据证明了irs1 rs2943656a>g的频率增加与bmi和脂肪数量降低有关；因此通过本发明的应用方法，可更加全面认识到irs1基因的突变在决定2型糖尿病相关性状的易感性中发挥作用。

33、下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。