丽鱼三代虫重组丝氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法及其应用

本发明涉及鱼类寄生虫蛋白表达和功能应用研究，具体地，涉及丽鱼三代虫重组丝氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法及其应用。

背景技术：

1、单殖吸虫(monogenean)，隶属于扁形动物门(platyhelminthes)、吸虫纲(trematoda)、单殖吸虫亚纲(monogenea)，广泛寄生于世界各地的海洋、咸淡水以及淡水鱼类的鳃、皮肤、胃等部位，少数可寄生于两栖动物及爬行动物，是多样性最高的鱼类外寄生虫。单殖吸虫借助具锚钩、吸铗和边缘小钩的后吸器固着到宿主寄生部位，常造成局部组织损伤，导致其它病原继发感染，给鱼类养殖业造成巨大经济损失。其中，主要寄生于体表和鳃的三代虫(gyrodactylus spp.)曾给包括鲑鱼、金鱼、罗非鱼等在内的许多咸淡水养殖物种带来严重危害。

2、作为联合国粮农组织推荐的重要养殖鱼类，罗非鱼在我国南方地区广泛养殖，我国已成为世界上最大的罗非鱼养殖和出口国。三代虫是罗非鱼养殖过程中的常见病害，在墨西哥太平洋海岸，三代虫感染造成近20000条罗非鱼苗在三天内死亡；近两年有埃及地区的报道表明，丽鱼三代虫(gyrodactylus cichlidarum)经常与嗜水气单胞菌等细菌混合感染，极大的增加了池塘养殖罗非鱼的死亡率。

3、现有技术对单殖吸虫病的防治以广谱性药物杀虫为主，常用的药物的原料主是移植农药(敌百虫、辛硫磷)、畜禽兽药(地克珠利、氯苯胍)和医药(甲苯咪唑、吡喹酮)，长期或超剂量的使用会导致耐药性增加、药物残留以及环境污染等问题，有害鱼类健康，加大病害防治难度。目前单殖吸虫病缺乏预防为主的防控方法，针对于单殖吸虫的分子药物以及疫苗方面的研究近乎空白，至今只有日本报道了一例本尼登虫疫苗的专利。因此，开发针对单殖吸虫病的分子防治药物以及疫苗研制，对罗非鱼养殖产业具有重要意义。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中缺少罗非鱼单殖吸虫病害防治和水产养殖中鱼药滥用的问题，本发明提供了丽鱼三代虫重组丝氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法及其应用。

2、本发明的第一个目的是提供一种丽鱼三代虫的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白。

3、本发明的第二个目的是提供所述的丽鱼三代虫重组丝氨酸蛋白酶抑制蛋白作为免疫原在制备防治罗非鱼单殖吸虫病的产品中的应用。

4、本发明的第三个目的是提供一种丽鱼三代虫的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的多克隆抗体。

5、本发明的第四个目的是提供一种防治罗非鱼单殖吸虫病的生物制剂。

6、本发明的第五个目的是提供一种编码丽鱼三代虫的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的核苷酸分子。

7、本发明的第六个目的是提供一种用于制备丽鱼三代虫重组丝氨酸蛋白酶抑制剂的重组表达载体。

8、本发明的第七个目的是提供一种丽鱼三代虫重组丝氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法。

9、为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

10、深入地了解宿主与单殖吸虫相互作用过程中宿主的免疫反应和单殖吸虫的免疫逃逸机制是开发有效的单殖吸虫病分子防治药物或疫苗的必要手段。本发明通过对主要寄生于罗非鱼体表的丽鱼三代虫分泌的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(serpin蛋白)的表达鉴定和功能研究，探究该蛋白的重组表达方法和其在丽鱼三代中与宿主相互作用中的功能，为单殖吸虫分子疫苗候选靶向分子研究奠定基础。

11、本发明首先对丽鱼三代虫分泌蛋白gcserpin部分基因片段进行race扩增，获得基因全长后在进行重组载体构建和蛋白表达，随后研究重组rgcserpin蛋白功能。本发明首次获得了gcserpin基因全长，成功构建了重组表达载体并且高效表达了rgcserpin蛋白，经实验证明rgcserpin蛋白对部分罗非鱼免疫相关酶活性有显著抑制作用；gcserpin蛋白主要存在于虫体的肠腔，口、咽、头器等部位；通过蛋白质印迹检测天然gcserpin蛋白；elisa方法探究rgcserpin蛋白对罗非鱼几种免疫相关酶活抑制情况；免疫荧光技术探究gcserpin蛋白在虫体中的定位以及探究rgcserpin蛋白在体外对罗非鱼粘液和血清杀虫作用的影响，证实rgcserpin在体外能够抑制罗非鱼粘液和血清对丽鱼三代虫的杀灭作用，体外抗体中和gcserpin的分泌也可减少丽鱼三代虫对罗非鱼的感染强度。

12、一种丽鱼三代虫的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白，其氨基酸序列如seq id no.4所示。

13、所述氨基酸序列如seq id no.4所示的丽鱼三代虫重组丝氨酸蛋白酶抑制蛋白作为免疫原在制备防治罗非鱼单殖吸虫病的产品中的应用也应在本发明的保护范围之内。所述氨基酸序列如seq id no.4所示的丽鱼三代虫重组丝氨酸蛋白酶抑制蛋白作为免疫原引起宿主的免疫系统产生抗体或在体外制备的抗体，能够阻断和/或抑制丽鱼三代虫的感染。

14、优选地，所述产品包括多克隆抗体。

15、优选地，所述罗非鱼包括尼罗罗非鱼。

16、优选地，所述罗非鱼包括幼鱼。

17、优选地，所述单殖吸虫病的病原体包括丽鱼三代虫。

18、一种丽鱼三代虫的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的多克隆抗体，以氨基酸序列如seq idno.4所示的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白作为免疫原免疫动物得到。

19、优选地，所述动物包括大白兔。

20、一种防治罗非鱼单殖吸虫病的生物制剂，包含丽鱼三代虫的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的多克隆抗体，所述多克隆抗体以氨基酸序列如seq id no.4所示的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白作为免疫原免疫动物得到。

21、优选地，所述动物包括大白兔。

22、一种编码丽鱼三代虫的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的核苷酸分子，其核苷酸序列包含如seq id no.3所示的序列。

23、优选地，所述核苷酸分子的核苷酸序列如seq id no.2所示。

24、一种用于制备丽鱼三代虫重组丝氨酸蛋白酶抑制剂的重组表达载体，所述重组表达载体为表达所述氨基酸序列如seq id no.4所示的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的载体。

25、优选地，所述重组表达载体连接有核苷酸序列如seq id no.3所示的核苷酸分子。

26、优选地，所述重组表达载体连接有核苷酸序列如seq id no.2所示的核苷酸分子。

27、优选地，所述重组表达载体以e1expression vector为骨架。

28、更优选地，所述重组表达载体由核苷酸序列如seq id no.3所示的核苷酸分子连接至e1expression vector的6×his标签和t7终止子之间得到。

29、更优选地，所述重组表达载体由核苷酸序列如seq id no.2所示的核苷酸分子连接至e1expression vector的6×his标签和t7终止子之间得到。

30、一种丽鱼三代虫重组丝氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法，将重组表达载体导入宿主细胞，诱导表达；所述重组表达载体为表达所述氨基酸序列如seq id no.4所示的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的载体。

31、优选地，所述重组表达载体包含核苷酸序列如seq id no.3所示的核苷酸分子。

32、优选地，所述重组表达载体连接有核苷酸序列如seq id no.2所示的核苷酸分子。

33、优选地，所述重组表达载体以e1expression vector为骨架。

34、更优选地，所述重组表达载体由核苷酸序列如seq id no.3所示的核苷酸分子连接至e1expression vector的6×his标签和t7终止子之间得到。

35、更优选地，所述重组表达载体由核苷酸序列如seq id no.2所示的核苷酸分子连接至e1expression vector的6×his标签和t7终止子之间得到。

36、优选地，所述宿主细胞包括大肠杆菌。

37、更优选地，所述大肠杆菌为bl21(de3)。

38、优选地，所述诱导表达的条件包括：所述宿主细胞的培养体系中iptg的终浓度为0.2mm～1mm，诱导温度为20℃～37℃，诱导时间为4h～16h。

39、更优选地，所述宿主细胞的培养体系中iptg的终浓度为0.6mm。

40、更优选地，所述诱导温度为37℃。

41、更优选地，所述诱导时间为16h。

42、进一步优选地，所述诱导表达的条件为：所述宿主细胞的培养体系中iptg的终浓度为0.6mm，诱导温度为37℃，诱导时间为16h。

43、任一所述制备方法得到的丽鱼三代虫重组丝氨酸蛋白酶抑制剂也应在本发明的保护范围之内。

44、任一所述制备方法得到的丽鱼三代虫重组丝氨酸蛋白酶抑制剂在制备防治罗非鱼单殖吸虫病的产品中的应用也应在本发明的保护范围之内。

45、优选地，所述丽鱼三代虫重组丝氨酸蛋白酶抑制剂作为免疫原。

46、优选地，所述产品包括多克隆抗体。

47、优选地，所述罗非鱼包括尼罗罗非鱼。

48、优选地，所述罗非鱼包括幼鱼。

49、优选地，所述单殖吸虫病的病原体包括丽鱼三代虫。

50、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

51、本发明首次通过克隆和race扩增获得了gcserpin基因的cdna序列，并首通过重组载体构建和原核表达纯化得到rgcserpin蛋白。rgcserpin蛋白参与丽鱼三代虫与罗非鱼的免疫互作及免疫调控，在体外中和gcserpin蛋白的分泌能显著减少丽鱼三代虫对罗非鱼的感染强度。gcserpin是优异的用于制备防治罗非鱼单殖吸虫病的分子疫苗的靶向作用蛋白，对于缓解渔药滥用造成环境损伤以及绿色杀虫具有重要良好的应用前景。