一种cfDNA末端修复及建库的方法与流程

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种cfdna末端修复及建库的方法。

背景技术：

1、血浆游离dna(circulating cell free dna,cfdna)是一种存在于血浆中的游离的、不与细胞核融合的dna片段。cfdna可以用于非侵入性的液体活检，用于癌症早期筛查、疾病监测和治疗效果评估。此外，cfdna也被用于产前诊断、器官移植监测等领域。目前研究学者发现血浆cfdna携带单链dna末端，即锯齿状末端。研究发现88％的血浆cfdna分子均携带锯齿状末端，cfdna锯齿状末端的产生与dna核酸酶活性有关。cfdna锯齿状末端代表了cfdna的固有特性，是疾病中一种新生物学标志物。

2、专利公告号为cn111378632b的文献提供了一种cfdna末端修复酶组合物，由酶ⅰ(taq dna聚合酶及klenow fragment，exo-)和酶ⅱ(t4polynucleotide kinase，简称t4pnk)组成，可以使cfdna在dntp存在下进行dna双链修复及3’端加a，并使cfdna 5’端发生磷酸化修饰。

3、但此种cfdna末端修复法并未保留cfdna锯齿状末端序列结构，导致这部分数据信息缺失。并且klenow fragment，exo-具有3’-5’外切酶活性和聚合酶活性，会导致cfdna在末端修复补平时会在3’端额外添加一个或多个核苷酸，进而引起信息分析差异。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提出了一种cfdna末端修复方法，末端修复反应体系采用包含hemo klentaq和t4 polynucleotide kinase的末端修复酶组合试剂，以及包含dmctp等组分在内的10×末端修复缓冲液试剂，可以在修复cfdna末端的同时保留cfdna锯齿状末端序列。

2、本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供了一种保留cfdna锯齿状末端的末端修复方法，包括如下步骤：

3、s1.配置10×末端修复缓冲液试剂和末端修复酶组合试剂；

4、所述10×末端修复缓冲液试剂包含dmctp，所述末端修复酶组合试剂包含hemoklentaq和t4 polynucleotide kinase；

5、s2.配置末端修复反应体系，所述末端修复反应体系包含所述10×末端修复缓冲液试剂、所述末端修复酶组合试剂和cfdna，混匀再置于pcr仪上进行末端修复反应；

6、所述末端修复反应同时完成了三项操作：保留cfdna锯齿状末端序列的末端平齐化，在cfdna的3’端添加da，以及在cfdna的5’端修饰磷酸基团，从而获得具有粘性末端a且保留cfdna锯齿状末端序列的cfdna片段。

7、hemo klentaq是截短后的taq dna聚合酶，它缺失了n端的280个氨基酸。hemoklentaq还有其它突变，这些突变使它能够耐受全血中存在的抑制剂。此酶能够扩增人和小鼠全血样品中的dna而无需事先提纯。在大多数抗凝剂存在下hemo klentaq依然表现良好，包括肝素、柠檬酸和edta。

8、hemo klentaq不具有5’→3’外切酶活性和3’→5’外切酶活性，在保留cfdna锯齿状末端序列的基础上经过末端平齐化的cfdna 3’端添加碱基a，以获得具有粘性末端a的cfdna片段。本发明寻找到hemo klentaq，t4polynucleotide kinase二者同时具备活性的反应条件，即缓冲液条件和反应温度控制，可以将末端修复和加da在一步完成。

9、加入带有甲基化修饰的胞嘧啶(dmctp)，代替普通胞嘧啶，与末端修复酶组合物处理cfdna以产生通过dmctp进行末端平齐化且3’端加a的cfdna，因此通过后续数据分析能够获得cfdna锯齿状末端序列的遗传信息。

10、优选地，所述hemo klentaq与所述t4 polynucleotide kinase的体积比为1:(0.1-1)。

11、优选地，每50μl所述末端修复反应体系中，所述dmctp浓度4-5mm。

12、优选地，所述10×末端修复缓冲液试剂还包含dgtp、dttp和datp，(dmctp+dgtp+dttp)和datp的摩尔比为(3-5)：(10-15)。

13、末端平齐化所需的四种脱氧核糖核苷三磷酸很少，末端平齐化后通过hemoklentaq为dna双链的3’端添加碱基a，所以反应体系中datp浓度对于cfdna 3’端加a效率影响较大。

14、优选地，每50μl所述末端修复反应体系中，所述10×末端修复缓冲液试剂还包含：0.9-1.1m tris-hcl、0.1-0.2m mgcl2、0.01-0.15m dtt、0.1-0.2m kcl和10-30mmatp。

15、优选地，每50μl所述末端修复反应体系中，所述末端修复酶组合试剂包含：2-4μlhemo klentaq、1-2μl t4 polynucleotide kinase、90-100mm tris-hcl和体积浓度45-50％的甘油。

16、优选地，每50μl所述末端修复反应体系中，所述cfdna的加入量至少为1ng。

17、本发明优化了反应体系进行甲基化建库，使用先建库后转化的实验方案可以避免转化效率低下、文库污染等问题，提高建库效率和准确性。另外，仅需要1ng的cfdna就可以建立高质量的文库，可以在样本量极少的情况下进行研究，节省了实验成本和时间。

18、优选地，反应条件包括：所述末端修复反应体系ph值为7.0～8.5，将所述末端修复反应体系先进行80-85℃的热盖处理，再在35-40℃反应15-30min，然后在60-70℃反应15-30min。

19、本发明还提供了一种基于上述任一种cfdna末端修复方法的对血浆或精浆样本进行cfdna末端修复的应用。

20、在以上技术方案的基础上，本发明还提供一种cfdna建库方法，包括如下步骤：

21、步骤a.使用上述任一项所述的末端修复方法进行cfdna末端修复；

22、步骤b.在末端修复体系中直接加入illumina adaptor、t4 dna ligase及t4dnaligase buffer，进行接头连接；

23、步骤c.接头连接产物进行磁珠纯化，去除反应体系中的酶、盐离子及残余接头；

24、步骤d.进行cfdna甲基化处理，回收甲基化的cfdna；

25、步骤e.进行pcr扩增并将扩增产物纯化回收，得到cfdna测序文库。

26、因需要通过dmctp进行末端修复，以保证对cfdna锯齿状末端序列进行保留，因此，需要先进行末端修复与接头连接，再进行甲基化转化实验，所以需要在末端修复后，通过不受甲基化转化影响的接头进行接头连接。并且在末端修复后，无需将产物纯化就可以进行接头连接，减少产物损失。

27、本发明还提供所述的cfdna建库方法在对血浆或精浆样本的cfdna进行测序中的应用。

28、本发明相对于现有技术具有以下有益效果：

29、(1)本发明通过dmctp进行末端修复，带有甲基化修饰的胞嘧啶(dmctp)，代替普通胞嘧啶(dmctp)，以保证对cfdna锯齿状末端序列进行保留。采用的末端修复酶组合试剂中的hemo klentaq不具有5’→3’外切酶活性和3’→5’外切酶活性，可以保留锯齿状末端、末端平齐化并3’端添加碱基a，以获得具有粘性末端a的cfdna片段。本发明末端修复反应的同时保留了cfdna锯齿状末端序列，因此，通过后续数据分析能够获得cfdna锯齿状末端序列的遗传信息。

30、(2)本发明减少了所需使用的cfdna末端修复酶的种类，另外也仅需要1ng的cfdna就可以建立高质量的cfdna的测序文库，可以在样本量极少的情况下进行研究，节省了有限的样本资源，降低了实验成本。

31、(3)本发明采用先建库后甲基化转化的实验方案，可以避免转化效率低下、文库污染等问题，提高建库效率和准确性。通过不受甲基化转化影响的接头进行接头连接，并且在末端修复后，无需将产物纯化就可以进行接头连接，减少产物损失。