建立基于水疱性口炎病毒载体的复制型重组病毒用于研究SADS-CoV入侵和疫苗开发

本发明属于生物，涉及建立基于水疱性口炎病毒载体的复制型重组病毒用于研究sads-cov入侵和疫苗开发。

背景技术：

1、2017年，中国广东猪场的新生仔猪出现严重腹泻，分离并发现了一种新型猪急性腹泻综合征冠状病毒(sads-cov)。该病毒是单股正链的rna病毒，与菊头蝠冠状病毒hku2具有95％的核苷酸序列同一性，可导致5日龄以下仔猪高达90％的死亡率。据报道，sads-cov具有对多个物种细胞的感染嗜性，并且能感染人类呼吸道和肠道原代细胞，对其潜在的跨种传播的风险需要引起重视。

2、目前，通过猪急性腹泻综合征冠状病毒的反向遗传学技术制备的感染性克隆仍然需要在生物安全三级实验室操作。因此对该病毒的研究受限于安全性的条件，其广泛的宿主嗜性的科学问题并没有被解决。猪急性腹泻综合征冠状病毒的刺突蛋白整合到以逆转录病毒为载体的假病毒颗粒的效率不高，导致感染率很低，迫切需要开发一种在生物安全二级实验室操作的安全可靠、实用高效的研究病毒入侵的工具。

3、水疱性口炎病毒(vsv)是一种子弹状的单股负链rna病毒，属于弹状病毒科。基因组长约11k,有5个结构基因，分别编码糖(glyco，g)蛋白、基质(matrix，m)蛋白、磷(phosphor)蛋白、大聚合酶(large，l)蛋白和核衣壳(nucleocapsid，n)蛋白。g蛋白介导病毒结合以及与宿主细胞膜融合，l和p蛋白是病毒rna依赖的rna聚合酶的亚基。vsv能够感染牛、马、羊等多种动物并致病，表现为足部和口部病变，感染人体产生的症状较轻，安全等级较低，比较容易开展研究。vsv在哺乳动物和许多其他的细胞中能够迅速产生高滴度的病毒，病毒颗粒的出芽不需要vsv g蛋白，可以容纳并包装外源的包膜蛋白到达病毒表面，并且基因组简单容易操作，这些特性导致了重组vsv病毒的发展。

4、vsv病毒的反向遗传(reverse genetics)系统包括全长的基因组质粒和辅助质粒，商品化比较成熟。全长的基因组质粒包括vsv基因组rna互补链(antigenome)的cdna序列，在细胞内过表达t7 rna聚合酶的帮助下，由t7启动子启动转录出vsv基因组rna互补链。在细胞内过表达n，p，l蛋白形成rnp(ribonucleoprotein)复合物，识别vsv基因组rna互补链合成病毒基因组rna，再被rnp识别，转录为mrna，利用宿主的核糖体翻译为病毒的蛋白质，再进行组装，出芽，形成病毒颗粒。

5、重组vsv病毒在此基础上，用异源包膜糖蛋白基因取代vsv基因组原本的g基因，并且该糖蛋白能够被整合到vsv病毒颗粒的表面，通过连续传代获得适应性突变，从而获得能够高效地进行多轮感染的病毒。这种重组病毒在体外和体内都具有复制能力，有助于研究在实验系统中复制效率低下的靶向病毒。一些高度减毒形式的重组vsv病毒在动物体内没有毒性，并且具有复制能力的重组vsv现在已在多项临床试验中显示出安全性和免疫原性。vsv在人类中的血清阳性率非常低，为使用vsv作为潜在的疫苗载体提供支持。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供建立基于水疱性口炎病毒载体的复制型重组病毒用于研究sads-cov入侵和疫苗开发。

2、第一方面，本发明提供了重组水疱性口炎病毒，其基因组序列为将水疱性口炎病毒基因组序列中的g基因替换为猪急性腹泻综合征冠状病毒的刺突蛋白胞质尾部截断基因sδ11；且该重组水疱性口炎病毒颗粒表面嵌合所述猪急性腹泻综合征冠状病毒的刺突蛋白胞质尾部截断；

3、所述刺突蛋白胞质尾部截断的氨基酸序列为序列2。

4、上述重组水疱性口炎病毒中，所述刺突蛋白胞质尾部截断基因sδ11的核苷酸序列为序列1。

5、第二方面，本发明提供了一种制备第一方面所述重组水疱性口炎病毒的方法，包括如下步骤：利用vsv病毒系统拯救获得所述重组水疱性口炎病毒；

6、所述vsv病毒系统包括pvsv-venus-sads-cov sδ11基因组质粒和辅助质粒；

7、所述pvsv-venus-sads-cov sδ11基因组质粒为将水疱性口炎病毒基因组质粒pvsv-venus-vsv g中的g基因替换为第一方面中的所述刺突蛋白胞质尾部截断基因sδ11，其他碱基不变，得到的质粒。

8、上文所述方法包括如下步骤：将所述pvsv-venus-sads-cov sδ11基因组质粒和所述辅助质粒转染细胞，包装得到重组水疱性口炎病毒；

9、所述辅助质粒包括pcag-t7 rna聚合酶质粒、pcag-vsv n质粒、pcag-vsv p质粒、pcag-vsv g质粒、pcag-vsv l质粒和pcag-vsv m质粒。

10、上文所述方法中，具体转染为包括7个质粒(pvsv-venus-sads-cov sδ11质粒、pcag-t7 rna聚合酶质粒、pcag-vsv n质粒、pcag-vsv p质粒、pcag-vsv g质粒、pcag-vsv l质粒和pcag-vsv m质粒)共转染的细胞为高转染率的293t细胞。

11、所述细胞为293t细胞。

12、第三方面，本发明提供了由第二方面所述方法制备的重组水疱性口炎病毒。

13、第四方面，本发明提供了第二方面中所述pvsv-venus-sads-cov sδ11基因组质粒。

14、第五方面，本发明提供了第一方面或第三方面所述的重组水疱性口炎病毒在如下任一种的应用：

15、1)制备预防或治疗猪急性腹泻综合征冠状病毒引发的疾病产品；

16、2)制备猪急性腹泻综合征冠状病毒抗体产品；

17、3)制备中和猪急性腹泻综合征冠状病毒产品；

18、4)制备猪急性腹泻综合征疫苗。

19、第六方面，本发明提供了一种产品，其包括第一方面或第三方面所述的重组猪急性腹泻综合征冠状病毒或第二方面中的所述pvsv-venus-sads-cov sδ11基因组质粒；

20、所述产品具有如下任一功能：

21、1)预防或治疗猪急性腹泻综合征冠状病毒引发的疾病；

22、2)产生猪急性腹泻综合征冠状病毒抗体；

23、3)中和猪急性腹泻综合征冠状病毒。

24、本发明通过将vsv基因组原本的糖蛋白基因替换为猪急性腹泻综合征冠状病毒的刺突蛋白基因，通过vsv病毒的反向遗传技术拯救(rescue)出重组vsv病毒，其病毒颗粒表面嵌合猪急性腹泻综合征冠状病毒的刺突蛋白。病毒通过连续传代，产生适应性突变，使得突变后的刺突蛋白(刺突蛋白胞质尾部截断)整合到病毒颗粒表面的效率更高，因此可以用于研究病毒入侵和宿主嗜性。利用基因工程制备的重组嵌合病毒能够在小鼠体内产生中和抗体，展现了开发为重组vsv载体sads-cov疫苗的潜力。

25、本发明与现有技术相比，具有三个方面的优势。主要体现在以下方面：

26、(1)本发明采用基因工程的手段，编辑商品化的vsv基因组质粒，将vsv原本的g基因替换为目的病毒的刺突蛋白基因。病毒通过连续传代，发生适应性突变，使得刺突蛋白突变基因整合到病毒颗粒表面的效率更高，获得感染率更高的突变病毒。采用基因工程手段，将vsv原本的g基因替换为目的病毒的刺突蛋白突变基因，构建重组vsv，该重组vsv相比于只能进行单轮感染的假病毒系统，由于重组vsv基因组上有目的病毒的刺突蛋白突变基因和荧光蛋白基因，因此在包含目的病毒受体的细胞中能够自我复制进行多轮感染，增强感染率，通过定量荧光蛋白进行高通量筛选抗病毒药物。

27、(2)本发明建立的重组vsv病毒的反向遗传系统相比于拯救病毒基因组全长的感染性克隆，分子操作更加简便，便于替换不同目的病毒的包膜蛋白基因。本方法建立的重组vsv病毒针对研究的病毒生命周期更加明确，旨在研究目的病毒的包膜蛋白基因依赖的病毒入侵靶细胞的过程。并且由于vsv病毒载体的相对安全性，有效地解决了生物安全的顾虑，可以在生物安全二级实验室中进行操作。

28、(3)本发明采用基于重组水疱性口炎病毒的初次免疫和加强免疫策略，尝试开发一种有效针对猪急性腹泻综合征冠状病毒(sads-cov)的候选疫苗。监测重组病毒rvsv-venus-sads sδ11免疫组与pbs对照组的小鼠体重变化没有显著性差异，并且能够在小鼠体内诱导出有效的中和抗体，为保护小鼠免受sads-cov感染提供了可能。