体外合成不同分子尺寸和精细结构的糖原状α-葡聚糖的方法

本发明涉及一种体外合成不同分子尺寸和精细结构的糖原状α-葡聚糖的方法，属于食品，药品和医学。

背景技术：

1、糖原是一种存在于人体，动物及古生菌中的能量储存物质，在能量代谢中起着重要作用。目前糖原的提取方法可分体内提取法和体外合成法，其中体内提取法由于生物体内复杂的合成环境及提取方法的损伤，使得提取的糖原具有较宽的分散性以及不均匀的分支结构，而体外酶法合成可以通过对结构和功能进行精确设计，获得结构可控且理化特性稳定的α-葡聚糖。糖原状α-葡聚糖作为用于复杂生物环境的纳米颗粒，需要较多参数才能得到很好的控制。这包括糖原的分子质量和分支模式(即，分支之间的间距，分支的程度和分支的链长度)，它会影响糖原的粒度，溶解度和酶的可及性。在对gng进行化学或生化修饰以获得功能衍生物的过程中，取代基可能位于颗粒的内部或表面。因此，gng的大小和分支模式显著影响其功能性质。(powell p o，sullivan m a，sheehy j j，et al.acidhydrolysis and molecular density of phytoglycogen and liver glycogen helpsunderstand the bonding in glycogenα(composite)particles[j].plos one，2015，10(3):1-20.)。

2、日本glico健康研究所发现分子量在106数量级的gng可以维持血糖水平，降低血液中胆固醇水平；具有免疫刺激活性和抗肿瘤活性，可以预防代谢紊乱，可以抑制结肠炎，可以作为基因传递载体以及蛋白质和药物传递系统，可以作为临床诊断标记化学传感器，可以抑制uvb导致的人角质细胞的氧化应激，抑制人表皮角质细胞中活性氧ros的积累。gng不仅是能量来源，还是一种激活细胞的信号分子；英国利兹贝克特大学研究人员发现gng是维持血糖稳态和细胞水合的关键调节剂；捷克的研究团队发现gng可以作为构建体内成像纳米制剂的载体；中国江南大学药学院的研究团队发现gng可以作为药物载体和免疫佐剂，增强实体瘤渗透和基因递送效率。此外，kakutani等人研究表明平均分子质量超过107da的gng几乎不具有抗肿瘤活性。且市面上的牛肝糖原、牡蛎糖原和指甲履螺糖原的分子质量均在2×106～6×106da范围内。

3、体外三酶协同法(蔗糖磷酸化酶-α-葡聚糖磷酸化酶-分支酶法，sp-gp-be法)可以以蔗糖为底物合成糖原状α-葡聚糖，由于其生物安全和生物可降解的性质，成为了生物医学合成纳米颗粒的理想替代品。然而在复杂的生物环境中，需要对糖原状α-葡聚糖纳米颗粒的结构参数进行更精细的控制。其颗粒尺寸和表面链的疏松程度将对其生物医学功能产生较为显著的影响。专利cn113481261b公开了一种体外三酶协同法制备得到的gng的方法，但是其相对分子量保持仍在107da数量级，亟待进一步通过精细调控获得结构可控，理化特性稳定，且分子量进一步降低的糖原状α-葡聚糖。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的不足。本发明在体外三酶协同法(蔗糖磷酸化酶(sp)-α-葡聚糖磷酸化酶(gp)-分支酶法(be)，sp-gp-be法)的技术基础之上通过引入4-α-糖基转移酶(tuα-gt糖基转移酶)，提供了一种体外合成不同分子尺寸和精细结构的糖原状α-葡聚糖的方法，通过调整tuα-gt糖基转移酶的加酶比例，达到了进一步调控分子尺寸和精细结构的效果，并且进一步降低了糖原状α-葡聚糖的分子量。

2、本发明提供了一种体外制备不同精细结构的糖原状α-葡聚糖的方法，所述方法为：在含蔗糖和麦芽三糖的反应体系中，用酶催化生产糖原状α-葡聚糖；所述蔗糖与麦芽三糖的摩尔比例为(300-1500)：1；所述酶为：蔗糖磷酸化酶、α-葡聚糖磷酸化酶、分支酶和tuα-糖基转移酶；所述蔗糖磷酸化酶、α-葡聚糖磷酸化酶和分支酶的酶活力添加比例为1:1:(300-1000)；

3、所述蔗糖磷酸化酶在登录号为genbank：aan58596.1的glga氨基酸序列的基础上进行了如下突变：第47位苏氨酸突变为丝氨酸，第62位丝氨酸突变为脯氨酸，第77位酪氨酸突变为组氨酸，第128位缬氨酸突变为亮氨酸，第140位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第144位谷氨酰胺突变为精氨酸，第155位天冬酰胺突变为丝氨酸，第249位天冬氨酸突变为甘氨酸；所述α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列如登录号为genbank：ae000704中的glgp氨基酸序列所示；所述tuα-糖基转移酶的氨基酸序列登录号为abp49821.1。

4、在一种实施方式中，所述方法为：将蔗糖和麦芽三糖混合，40-60℃保温至少30min后加入α-葡聚糖磷酸化酶，反应10-60min后加入蔗糖磷酸化酶、分支酶和tuα-糖基转移酶。

5、在一种实施方式中，所述蔗糖与麦芽三糖的摩尔比例为600：1。

6、在一种实施方式中，所述蔗糖在反应体系中的浓度为100-300mm，可选的，所述蔗糖在反应体系中的浓度为240mm。

7、在一种实施方式中，所述蔗糖磷酸化酶、α-葡聚糖磷酸化酶和分支酶的比例为1：1：400，所述蔗糖磷酸化酶的添加量为1-10u/ml，可选的，所述蔗糖磷酸化酶的添加量为2u/ml。

8、在一种实施方式中，所述tuα-糖基转移酶添加量为2-22u/ml，可选的，所述tuα-糖基转移酶添加量为6-22u/ml。

9、在一种实施方式中，所述反应体系中含有缓冲液以维持反应ph为6-8，可选的，维持反应ph为7；所述缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲液，可选的，所述缓冲液为磷酸氢二钠和磷酸氢二钾的复配缓冲液。

10、在一种实施方式中，所述缓冲液为240mm磷酸氢二钠和160mm磷酸氢二钾的复配缓冲液。

11、在一种实施方式中，反应时间为在10-20h，可选的，所述反应时间为16h。

12、在一种实施方式中，反应体系的温度为40-60℃，可选的，所述反应温度为55℃。

13、本发明还提供了所述方法在糖原状α-葡聚糖制备中的应用。

14、在一种实施方式中，所述应用是将所述方法用于制备分子量为4.5×106-9×106da的糖原状α-葡聚糖。

15、在一种实施方式中，所述应用是将所述方法用于制备z均回转半径为19-28nm的糖原状α-葡聚糖。

16、在一种实施方式中，所述应用是将所述方法用于制备分支度为7.4％-10.7％的糖原状α-葡聚糖。

17、在一种实施方式中，所述应用是将所述方法用于制备平均链长为8-10的糖原状α-葡聚糖。

18、有益效果：

19、本发明在sp-gp-be三酶法的基础上，进一步添加tuα-糖基转移酶，通过改变tuα-糖基转移酶的添加量，可以进一步改变得到的糖原状α-葡聚糖分子大小、平均链长、z均回转半径以及分支程度，从而改变糖原状α-葡聚糖的分子尺寸和精细结构。当蔗糖和麦芽三糖的摩尔比例为600:1，蔗糖磷酸化酶、α-葡聚糖磷酸化酶和分支酶的比例为1：1：400时，在tuα-糖基转移酶的添加量为2u-22u/ml时，反应得到的糖原状α-葡聚糖理化性质如下：

20、(1)糖原状α-葡聚糖相对分子量大小整体从107da降低到106da，当酶添加量≥6u/ml时，gng相对分子量最终稳定在4.939×106da～8.588×106da的范围内。

21、(2)糖原状α-葡聚糖的平均链长从8.74继续延长并除了gng-10之外均保持在8.76～9.99的范围内。

22、(3)糖原状α-葡聚糖的z均回转半径rz从30.0nm降低到保持19.3～28.0nm的范围内。

23、(4)糖原状α-葡聚糖的依然能保持较高的分支度，当tuα-糖基转移酶加酶量为22u/ml时，其产物分支度为10.7％。

24、(5)反应产率在9.0％～19.6％之间。