一种多基因甲基化联合检测方法及试剂盒与流程

本发明涉及基因检测，特别是涉及一种多基因甲基化联合检测方法及试剂盒。

背景技术：

1、目前，随着人们对肿瘤发病机制的分子生物学研究的不断深入，逐渐认识到表观遗传学在肿瘤发生、发展中的重要作用。

2、表观遗传学修饰，其主要表现形式包括：dna甲基化(dnamethyaltian)、组蛋白修饰(histone modification)、染色体重塑(chromatin remodeling)和小rna(microrna)调控等。与基因遗传改变不同，这些表观修饰在不改变碱基序列的前提下调控基因的表达，使之在细胞中形成独特的表型，影响细胞基因表达，并且将此影响随着细胞的分裂而在细胞和个体间遗传下去。它们比基因突变更频繁地发生，并可能坚持整个细胞生命，甚至为多代。表观修饰是将基因型与表型联系起来的纽带，其中的dna甲基化是最常见和最有开发价值的表观遗传修饰形式。

3、目前，普遍认为dna异常甲基化、特别是抑癌基因启动子区cpg岛的高甲基化对于肿瘤的发生、发展具有十分重要的作用；现有技术中，所采用的dna甲基化分析方法，包括：pcr荧光法，所采用的癌变分析方法，包括：tct检测以及倍体分析；但在上述方法中，基因通量均较低，灵敏度和特异性也无法达到较高水平。

技术实现思路

1、本发明的目的在于，提供一种多基因甲基化联合检测方法及试剂盒，进而解决现有技术中存在的上述所有问题或问题之一。

2、为解决上述技术问题，本发明的具体技术方案如下：

3、一方面，本发明提供一种多基因甲基化联合检测方法，包括以下步骤：

4、制备试剂盒：

5、确定十六种驱动基因；

6、基于十六种所述驱动基因设置pcr引物以及延伸引物，基于所述pcr引物以及所述延伸引物配制多重引物，将所述多重引物纳入试剂盒；

7、多基因联合分析：

8、获取待测样品，获取待测样品的基因组转化产物；

9、基于所述试剂盒设置pcr体系、扩增程序、消化体系、消化程序、延伸反应体系以及延伸反应程序；

10、基于所述pcr体系、所述扩增程序、所述消化体系、所述消化程序、所述延伸反应体系以及所述延伸反应程序对所述基因组转化产物依次进行扩增处理、消化处理以及延伸反应处理，得到延伸产物；

11、基于所述延伸产物进行离心处理，取上清液；

12、对所述上清液进行基于核酸质谱平台的多重分析，得到甲基化结果；

13、配置甲基化分类预测模型，将所述甲基化结果输入至所述甲基化分类预测模型，基于所述甲基化分类预测模型的分析结果对所述待测样品进行分类。

14、作为一种改进的方案，所述基于十六种所述驱动基因设置pcr引物以及延伸引物，基于所述pcr引物以及所述延伸引物配制多重引物，将所述多重引物纳入试剂盒，包括：

15、确认十六个种所述驱动基因的基因组gdna序列；

16、基于所述基因组gdna序列设置18条正向pcr引物、18条反向pcr引物以及29条延伸引物；

17、对所述18条正向pcr引物、所述18条反向pcr引物以及所述29条延伸引物合成，进行hplc纯化，并配制相应的扩增引物混合液以及延伸引物混合液；

18、将所述扩增引物混合液以及延伸引物混合液纳入所述试剂盒。

19、作为一种改进的方案，所述十六种驱动基因，包括：

20、cdh1、cdkn2a、cdkn2b、dapk1、hoxa9、mgmt、nid2、pax1、rassf1、sox1、shox2、tfpi2、timp3、tmeff2、trh和znf582；

21、内参基因为：actb和gapdh。

22、作为一种改进的方案，所述基于所述pcr体系、所述扩增程序、所述消化体系、所述消化程序、所述延伸反应体系以及所述延伸反应程序对所述基因组转化产物依次进行扩增处理、消化处理以及延伸反应处理，得到延伸产物，包括：

23、基于所述pcr体系和所述扩增程序对所述基因组转化产物进行扩增处理，得到pcr产物；

24、将所述pcr产物分装成两管，按照所述消化体系、所述消化程序以及相应的所述延伸引物混合液对两管所述pcr产物分别进行消化处理，得到消化产物；

25、在所述消化产物中加入延伸反应液，按照所述延伸反应体系以及所述延伸反应程序进行延伸反应处理，得到所述延伸产物。

26、作为一种改进的方案，所述扩增程序为：

27、94℃，2分钟；

28、

29、72℃，5分钟；

30、所述消化程序为：

31、37℃，40分钟；

32、85℃，5分钟；

33、所述延伸反应程序为：

34、94℃，30秒；

35、

36、72℃，3分钟。

37、作为一种改进的方案，所述基于所述延伸产物进行离心处理，取上清液，包括：

38、将所述延伸产物中加入水41μl，清洁树脂15mg；

39、或，

40、将所述延伸产物中加入水16μl，清洁树脂6mg；

41、之后对所述延伸产物进行脱盐去离子防干扰处理；

42、脱盐去离子防干扰处理后，进行3000g离心，时长为5分钟；

43、离心处理后，取所述上清液。

44、作为一种改进的方案，所述对所述上清液进行基于核酸质谱平台的多重分析，得到甲基化结果，包括：

45、采用核酸质谱平台的点样仪将上清液进行芯片点样；

46、采用analyzer分析仪芯片进行扫描，得到扫描结果；

47、分析所述扫描结果中各驱动基因的甲基化情况；

48、统计每个所述驱动基因的所述甲基化情况，得到所述甲基化结果。

49、作为一种改进的方案，所述将所述甲基化结果输入至所述甲基化分类预测模型，基于所述甲基化分类预测模型的分析结果对所述待测样品进行分类，包括：

50、设置所述甲基化分类预测模型的结果判别阈值；

51、将所述甲基化结果输入所述甲基化分类预测模型中，通过所述甲基化分类预测模型预测所述待测样品的甲基化风险得分；

52、将所述甲基化风险得分与所述结果判别阈值比对；

53、根据比对结果将所述待测样品划分为阳性组或阴性组。

54、作为一种改进的方案，所述配制相应的扩增引物混合液以及延伸引物混合液，包括：

55、将所述pcr引物稀释成100μm，之后工作液以每条引物浓度为0.5μm进行混合，得到所述扩增引物混合液；

56、将所述延伸引物稀释成500μm，之后根据每一条延伸引物的分子量，按体积进行混合，得到两管所述延伸引物混合液。

57、另一方面，本发明还提供一种多基因甲基化联合检测方法的试剂盒，包括：

58、用于甲基化检测的多重引物组；

59、所述多重引物组，包括：扩增引物混合液以及两种延伸引物混合液；

60、所述扩增引物混合液基于18条正向pcr引物以及18条反向pcr引物配制；

61、所述两种延伸引物混合液分别基于29条延伸引物配制。

62、本发明技术方案的有益效果是：

63、1、本发明所述的多基因甲基化联合检测方法，可以实现基于核酸质谱技术平台，实现多基因的联合检测，基于构建的预测模型实现多种基因位点的甲基化分析以及综合结果判定，灵敏度及特异性较高，操作简便，耗时短效率高，通量高成本低，结果易于判读，可拓展性强，具有较高的应用价值。

64、2、本发明所述的试剂盒，可以实现多基因的联合检测，灵敏度及特异性较高，通量高成本低，结果易于判读，具有较高的应用价值。