一种适用于ATAC-seq的植物叶片提取细胞核的方法及应用与流程

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种适用于atac-seq的植物叶片提取细胞核的方法及应用。

背景技术：

1、细胞核提取是分子生物学、遗传学和细胞生物学等领域中常用的实验操作。通过提取细胞核，可以分析基因组、rna和蛋白质等，以及进行基因组学、表观遗传学和转录组学等研究。染色质转座酶可及性测序(the assay for transposase-accessible chromatinusing high throughput sequencing，atac-seq)是利用高灵敏的tn5转座酶研究染色质可及性的实验技术。在了解生物发育分化、疾病发生等过程和基因表达调控机制的研究中占据非常重要的地位，atac-seq技术可通过测定染色质的开放区域直接获得染色质的可及性情况，具有细胞核需求量少、高效灵敏、易重复等优势，因此逐渐被科研人员广泛使用。

2、虽然atac-seq的应用较为成熟、广泛，但该技术大部分运用在动物和疾病等方面的研究上，在植物叶片方面的应用报道较少，这与植物叶片本身特性有很大关系。植物叶片等组织不但具有细胞壁、胞间连丝、次生代谢物，而且还富含叶绿体等细胞器，贮藏多糖多酚等能量物质，这些对植物细胞核的制备增加了许多困难。目前适用于atac-seq的植物叶片提取细胞核的方法存在制备的细胞核悬液杂质较多，且很难制备出完整的、形态较好的植物叶片的细胞核悬液等缺点。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提出了一种使杂质干扰减少、细胞核形态和质量均较好的适用于atac-seq的植物叶片提取细胞核的方法及应用。

2、本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供了一种适用于atac-seq的植物叶片提取细胞核的方法，包括步骤：

3、s1.将植物叶片组织进行液氮研磨得植物叶片组织粉末；

4、s2.取所述植物叶片组织粉末加入复合型细胞壁降解酶试剂对细胞壁进行酶解，然后细胞筛过滤收集液体；

5、s3.配制n种细胞核提取缓冲试剂，n＞1，采用差速离心法提取细胞核，每次离心后用所述n种细胞核提取缓冲试剂中的任一种重悬沉淀；

6、s4.采用percoll密度梯度离心的方法分离去除杂质，回收细胞核。

7、所述步骤s1中，用液氮将研钵充分预冷，研磨5-10min后称取0.15-0.2g组织粉末。

8、优选地，所述复合型细胞壁降解酶试剂包括崩溃酶和纤维素酶。

9、崩溃酶(driselase)一种水解细胞壁的复合酶，含昆布多糖酶，木聚糖酶，纤维素酶，半纤维素酶，果胶酶等组分，能有效针对植物细胞壁结构成分进行酶解。在降解植物细胞壁的过程中，崩溃酶和纤维素酶存在协同效应，彼此增强了酶的降解活性，通过底物降解量测定证明混合后总活性明显高于单独的活性之和。此前，还没有文献报道同时将崩溃酶和纤维素酶作为双酶组合同时用于atac-seq的植物叶片的细胞核提取的方法中。

10、优选地，所述复合型细胞壁降解酶试剂还包括离析酶、果胶酶和半纤维素酶中的一种或多种的组合。

11、离析酶(macerozyme)含高果胶酶和半纤维素酶活性。崩溃酶、纤维素酶和离析酶之间对植物细胞壁的降解两两之间均具有协同催化的作用。

12、进一步优选地，所述崩溃酶浓度为4.5-5.5mg/ml，所述纤维素酶浓度为14.5-15.5mg/ml，所述复合型细胞壁降解酶试剂中酶的总浓度不超过25mg/ml。

13、本发明优化了复合型细胞壁降解酶中各种类型的酶之间的配比和酶浓度，加速了降解过程，提升了植物细胞壁的降解效率。

14、优选地，所述步骤s2具体包括如下步骤：

15、s2-1.取28-32mg所述植物叶片组织粉末，加入0.9-1.1ml复合型细胞壁降解酶试剂，摇床孵育酶解25-35min；

16、s2-2.用38-42μm的细胞筛过滤，并收集液体。

17、优选地，所述摇床孵育酶解的反应条件为26-30℃，90-110r/min，ph4.0-5.0。

18、优选地，所述细胞核提取缓冲试剂包括npb试剂、neb2试剂和neb3试剂，

19、所述npb试剂包括：18-22mm chaps，18-22mm hepes，38-42mm nacl，85-95mm kcl，1.5-2.5mm edta，1×蛋白酶抑制剂；

20、所述neb2试剂包括：0.24-0.26m蔗糖，8-12mm tris-hcl(ph8.0)，8-12mm mgcl2，0.9-1.1％(v/v)tritonx-100，1×蛋白酶抑制剂；

21、所述neb3试剂包括：1.6-1.8m蔗糖，8-12mm tris-hcl(ph8.0)，1.8-2.2mm mgcl2，0.14-0.16％(v/v)tritonx-100，1×蛋白酶抑制剂。

22、所述npb试剂中使用chaps，chaps是一种两性离子洗涤剂，具有强大的细胞裂解和蛋白质提取能力，同时保留蛋白质构象和蛋白质-蛋白质相互作用可以在不改变蛋白质活性的前提下，有效地破坏细胞膜和细胞器膜.

23、所述npb试剂中使用还使用了hepes，hepes具有良好的生物相容性，可维持细胞核结构的稳定，利于保持细胞核的完整性，避免在提取过程中对核内物质造成损害。

24、另外，neb2试剂、neb3试剂中使用不同浓度的triton x-100，这种非离子表面活性剂具有疏水和亲水性，能有效地破坏细胞器结构，再利用ph为8.0的tris-hcl创造碱性环境，进一步促进细胞器破裂，有效提高细胞核的产量。

25、neb3中使用高浓度蔗糖形成高渗透压促进叶绿素浸出。npb试剂、neb2试剂和neb3试剂中都包含蛋白酶抑制剂，可以防止蛋白水解，从而保护核内的重要蛋白不被降解。

26、优选地，所述步骤s3具体包括如下步骤：

27、s3-1.离心后使用0.9-1.1ml所述npb试剂重悬沉淀；

28、s3-2.离心后使用0.9-1.1ml所述neb2试剂重悬沉淀；

29、s3-3.离心后使用0.5-0.7ml所述neb3试剂重悬沉淀；

30、s3-4.离心后使用0.9-1.1ml所述npb试剂重悬沉淀。

31、进一步优选地，所述步骤s3中离心温度均为3-5℃，每次离心后去上清，然后用预冷的细胞核提取缓冲试剂重悬沉淀。

32、所述步骤s4具体包括如下步骤：

33、s4-1在3-5℃，2000r/min离心8-12min，去上清，用0.9-1.1mlbufferb重悬沉淀，转移到离心管中；

34、s4-2从底部缓慢添加1.8-2.2ml 25％(v/v)percoll，使溶液分层，再从底部缓慢加入1.8-2.2ml 75％(v/v)percoll，使溶液分层；

35、s4-3在3-5℃，3500r/min离心14-16min，细胞核位于75％(v/v)percoll和25％(v/v)percoll之间，去上层液体，缓慢吸取目标细胞核层于新的离心管中；

36、s4-4用5倍体积的1x pbs缓冲液清洗沉淀，2～3次，每次用200r/min离心5min回收细胞核。

37、本发明所述步骤s4采用percoll这种低密度梯度分离液，其表面包被大小不均一的硅胶颗粒，在不同离心力作用下以不同速率共沉淀细胞核与其他细胞碎片，形成不同等渗层，用于分离细胞核层与其他的细胞器杂质，能获得背景干净的细胞核，减少对后续建库的影响。

38、本发明还提供了上述任一种适用于atac-seq的植物叶片提取细胞核的方法在制备细胞核提取液、atac-seq的建库及测序方面的应用。

39、本发明相对于现有技术具有以下有益效果：

40、(1)本发明在适用于atac-seq的植物叶片提取细胞核的方法中，采用了复合型细胞壁降解酶试剂，实现了对植物细胞壁结构成分的高效酶解。复合型细胞壁降解酶试剂中的不同酶在这一过程中展现出协同效应，显著增强了降解活性。混合后的酶活性明显超越了其各自单独活性的总和，因此复合型细胞壁降解酶试剂提升了植物细胞壁的降解效率，为细胞核的高质量提取和atac-seq建库提供了基础。

41、(2)本发明提供了更适于差速离心的细胞核提取缓冲试剂的组分，npb试剂使用chaps，可以在不改变蛋白质活性的前提下，有效地破坏细胞膜和细胞器膜；hepes具有良好的生物相容性，可维持细胞核结构的稳定，利于保持细胞核的完整性，避免在提取过程中对核内物质造成损害，减少对后续建库、测序分析结果的影响。

42、(3)本发明还采用了percoll低密度梯度分离液，其表面包被大小不均一的硅胶颗粒，在不同离心力作用下以不同速率共沉淀细胞核与其他细胞碎片，形成不同等渗层，用于分离细胞核层与其他的细胞器杂质，能获得背景干净的细胞核，减少对后续atac-seq建库的影响。