一种检测水疱性口炎病毒的引物和探针及其应用的制作方法

本发明属于病毒定量检测，具体涉及一种检测水疱性口炎病毒的引物和探针及其应用。

背景技术：

1、随着基因递送载体和基因编辑等生物技术的快速发展，基因治疗产品的临床应用不断取得新的进展，为难治性疾病提供了新的治疗方案。腺相关病毒载体因其理化性质稳定、致病性弱、整合风险低、外源基因表达持久等结构和生物学方面的优势，已成为体内基因治疗领域研究、应用最为广泛的载体之一。腺病毒相关载体相关生物制品，其中一种生产工艺基于昆虫细胞/杆状病毒包装系统。来源于细胞系的生物技术产品的一个共同特点是存在病毒污染的风险，这种污染在临床上可产生严重的后果。其中一种可能的污染来自原细胞系(细胞基质)本身，只有通过实行全面的病毒检测程序并在生产过程中对病毒的去除活灭活进行评估，才可能得到确实的保证。针对生产用细胞系，需要对细胞系和其它原材料进行检定，确保其不含非预期感染性病毒，才能有效的控制生物技术产品的潜在病毒污染。针对昆虫细胞系，已有文献报道有潜在病毒sf弹状病毒，虽然无证据表明其对人有感染性，但根据ich相关规定，需要试用已鉴定的“相关”病毒或特异“模型”病毒俩评估其工艺清除效果。sf弹状病毒指示水疱性口炎(vsv)病毒，可作为特异性模型病毒进行相应产品的病毒清除研究。

2、在病毒清除实验中，为了检测下游纯化步骤对模型病毒的去除效果，通常使用指示细胞噬斑法或tcid50法对病毒滴度进行检测。这种基于指示细胞的检测方法，细胞培养周期长，且实验结果会受指示细胞的状态和培养时间的影响。聚合酶链式反应(pcr)是检测目标核酸片段的有效方法，自1981年发明该技术以来，多种改进程序被引入以满足分子生物学领域的科研需求。实时荧光定量pcr(qpcr)方法已被开发应用于病毒检测以及病毒清除研究。该方法是通过实时监测荧光强度来检测并定量pcr产物的含量。qpcr中使用的dna聚合酶具有5’至3’的核酸内切酶活性，通过水解标记有荧光素和淬灭染料的寡核苷酸探针，产生荧光信号。将qpcr和荧光素标记探针相结合，在理论上qpcr可以检测到样品中个位数拷贝的病毒核酸。目前，在病毒清除验证中，qpcr主要被应用在亲和层析等指示细胞感染法不适用的工艺步骤中。另外，2020版药典增加了qpcr检测方法，为荧光定量技术在病毒检测和生物制品安全评价的应用提供了法规依据。

3、综上所述，亟需提供一种高特异性和高灵敏性的检测水疱性口炎病毒的引物和探针及方法。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种检测水疱性口炎病毒的引物和探针及其应用。本发明设计并优化后的vsv引物和探针，具有高特异性和灵敏性，进行基因扩增，扩增曲线呈现明显的指数期、平台期；本发明利用qpcr定量检测vsv病毒，相较于经典的病毒指示细胞噬斑实验，相对标准偏差小。所述方法在线性标准曲线、线性相关系数、范围(包括检测病毒拷贝数下限和上限)、准确度、精密度、灵敏度、检测限等方面符合ich法规要求。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种检测水疱性口炎病毒的引物和探针，所述检测水疱性口炎病毒的引物和探针，所述引物包括上游引物fp和下游引物rp；

4、所述上游引物fp的核苷酸序列包括seq id no:1所示的序列，所述下游引物rp的核苷酸序列包括seq id no:2所示的序列；

5、所述探针的核苷酸序列包括seq id no:3所示的序列。

6、本发明通过病毒rna序列进行blast比对，设计了水疱性口炎病毒的特异性引物探针。通过比对序列gc含量，tm值和二级结构等，选择性合成引物探针，并通过pcr实验进一步调整引物探针浓度、退火温度和延伸温度、时间等，确定优化后的反应参数。确定正向引物(fp)、逆向引物(rp)和探针(probe)如下所示：

7、seq id no:1：5‘-cgagatggctgataaggatctctt-3’。

8、seq id no:2：5‘-ctgaggtctgagatggagcag-3’。

9、seq id no:3：5‘-tgctgcagccagattccctgaatgccca-3’。

10、本发明中所述引物的特异性好，通过使用上述引物对常用病毒进行特异性扩增，结果显示所述引物对x-mulv，emcv，reo-3病毒的基因组无扩增，特异性好。

11、优选地，所述所述荧光探针的5’端含有荧光基团，3’端含有淬灭基团；所述荧光基团包括fam、tet、vic或hex中任意一种或至少两种的组合；所述淬灭基团包括tamra、mgb或bhq中任意一种或至少两种的组合。

12、第二方面，本发明提供了一种检测水疱性口炎病毒的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的检测水疱性口炎病毒的引物和荧光探针。

13、优选地，所述试剂盒还包括病毒核酸标准品和荧光定量pcr反应试剂。

14、优选地，所述病毒核酸标准品的制备方法包括：将103-104pfu的病毒稀释液调整为103-104拷贝的标准化ct值；根据调整后的标准化ct值，从高滴度病毒库纯化制备106拷贝的病毒核酸标准品，将106拷贝病毒核酸标准品按10倍梯度稀释产生1-105拷贝的目标病毒基因标准品。

15、本发明中病毒核酸标准品的制备方法包括以下步骤：

16、(1)使用qiaamp minelute virus spin kit提取病毒核酸；

17、(2)将病毒核酸10倍梯度稀释，通过pcr得到不同稀释度的ct值；

18、(3)通过比较检测ct值和标准化ct值，计算得到稀释倍数；

19、(4)将步骤(1)中核酸进行相应稀释，制备成病毒基因组标准品。

20、本发明中病毒核酸标准品病毒基因组标准品相比于rna片段标准品不需要通过dna片段进行反转录；不易降解，稳定性好。相比于dna或质粒标准品，反转录效率一致，不影响扩增效率的评估。该方法制备的标准品主要用于病毒清除研究中病毒清除效果的计算。

21、优选地，所述荧光定量pcr反应试剂包括one step primescript iii rt-qpcrmix。

22、本发明中所述荧光定量pcr反应可采用的常规的反转录酶和dna聚合酶进行扩增检测，根据不同酶调整合适的扩增程序。

23、第三方面，本发明提供了一种以非疾病诊断和/或治疗为目的的检测水疱性口炎病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

24、(1)采集并处理待测样品，配制荧光定量pcr体系；

25、(2)对待测样品和阳性标准品进行荧光定量pcr反应，得到待测样品和阳性标准品的荧光信号，对荧光信号进行数据处理，得到ct值及扩增曲线，所述荧光定量pcr反应的反应体系包括第一方面所述的检测水疱性口炎病毒的引物和荧光探针；

26、(3)根据阳性标准品的浓度和ct值，绘制荧光定量标准曲线，根据荧光定量标准曲线对待测样品进行定性和定量检测。

27、优选地，步骤(2)中所述荧光定量pcr反应的反应体系以终浓度计包括：1×-3×的onestep primescript iii rt-qpcrmix、700-1000nm的上游引物fp、700-1000nm的下游引物rp、100-400nm的探针。

28、本发明中，所述荧光定量pcr反应的反应体系中one step primescript iii rt-qpcr mix可以是1×、2×或3×等；所述荧光定量pcr反应的反应体系中上游引物fp的终浓度为700-1000nm，例如可以是700nm、800nm、900nm或1000nm等；下游引物rp的终浓度为700-1000nm，例如可以是700nm、800nm、900nm或1000nm等；探针的终浓度为100-400nm，例如可以是100nm、200nm、300nm或400nm等。

29、优选地，步骤(2)中所述荧光定量pcr反应的程序包括：步骤1：47-49℃，8-12min；步骤2：94-96℃，4-6min；步骤3：94-96℃，12-18sec；步骤4：58-62℃，0.8-1.2min；步骤3和步骤4，40-42个循环。

30、上述47-49℃中的具体点值可以选择47℃、48℃或49℃等。

31、上述8-12min中的具体点值可以选择8min、9min、10min、11min或12min等。

32、上述94-96℃中的具体点值可以选择94℃、95℃或96℃等。

33、上述4-6min中的具体点值可以选择4min、5min或6min等。

34、上述12-18sec中的具体点值可以选择12sec、14sec、16sec或18sec等。

35、上述58-62℃中的具体点值可以选择58℃、59℃、60℃、61℃或62℃等。

36、上述0.8-1.2min中的具体点值可以选择0.8min、0.9min、1.0min、1.1min或1.2min等。

37、上述40-42个循环中的具体点值可以选择40个循环、41个循环或42个循环等。

38、作为本发明的优选技术方案，所述检测水疱性口炎病毒的方法包括以下步骤：

39、(1)采集并处理待测样品，配制荧光定量pcr体系；所述荧光定量pcr反应的反应体系以终浓度计包括：1×-3×的one step primescript iii rt-qpcr mix、700-1000nm的上游引物fp、700-1000nm的下游引物rp、100-400nm的探针、5μl的模板、用ddh2o补足25μl体系；

40、(2)对待测样品和阳性标准品进行荧光定量pcr反应，所述荧光定量pcr反应的程序为：步骤1：47-49℃，8-12min；步骤2：94-96℃，4-6min；步骤3：94-96℃，12-18sec；步骤4：58-62℃，0.8-1.2min；步骤3和步骤4，40-42个循环；得到待测样品和阳性标准品的荧光信号，对荧光信号进行数据处理，得到ct值及扩增曲线；

41、(3)根据阳性标准品的浓度和ct值，绘制荧光定量标准曲线，根据荧光定量标准曲线对待测样品进行定性和定量检测。

42、第四方面，本发明提供了一种检测水疱性口炎病毒的系统，所述系统包括：样品制备模块、检测模块和分析模块；

43、所述样品制备模块用于执行包括：采集并处理待测样品，配制荧光定量pcr体系，所述pcr体系包括第一方面所述的检测水疱性口炎病毒的引物和探针；

44、所述检测模块用于执行包括：对荧光定量pcr体系进行荧光定量pcr反应；

45、所述分析模块用于执行包括：根据荧光定量标准曲线，对待测样品进行定性和定量检测；

46、所述荧光定量pcr反应的反应体系以终浓度计包括：1×-3×的one stepprimescript iiirt-qpcrmix、700-1000nm的上游引物fp、700-1000nm的下游引物rp、100-400nm的探针；

47、所述荧光定量pcr反应的程序包括：步骤1：47-49℃，8-12min；步骤2：94-96℃，4-6min；步骤3：94-96℃，12-18sec；步骤4：58-62℃，0.8-1.2min；步骤3和步骤4，40-42个循环。

48、第五方面，本发明提供了第一方面所述的检测水疱性口炎病毒的引物和探针、第二方面所述的检测水疱性口炎病毒的试剂盒或第四方面所述的检测水疱性口炎病毒的系统中的任意一种或至少两种的组合在制备检测水疱性口炎病毒的产品中的应用。

49、本发明中第一方面所述的检测水疱性口炎病毒的引物和探针、第二方面所述的检测水疱性口炎病毒的试剂盒或第四方面所述的检测水疱性口炎病毒的系统在生物安全、病毒检测、血液制品和病毒清除验证中具有重要的应用价值。

50、本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

51、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

52、(1)本发明设计并优化后的vsv病毒的引物和探针，具有高特异性和灵敏性，进行基因扩增后，扩增曲线呈现明显的指数期、平台期；

53、(2)本发明利用vsv病毒原液的滴度和经典的病毒噬斑实验，将病毒原液稀释并制备成106核酸标准品，使用标准品进行梯度稀释，制成1到105拷贝数的目标病毒基因标准品，进而生成标准曲线，使用该标准品生成的标准曲线，线性关系和相关系数好，孔间差异小，重复性高；

54、(3)利用qpcr定量检测vsv病毒，相较于经典的病毒噬斑实验，相对标准偏差小，所述方法在线性标准曲线、线性相关系数、范围(包括检测病毒拷贝数下限和上限)、准确度、精密度、灵敏度、检测限等方面符合ich法规要求。