一种鉴定橘湘红品种的SV分子标记及其应用

本发明涉及橘湘红育种领域，具体涉及一种鉴定橘湘红品种的sv分子标记及其应用。

背景技术：

1、柚(citrus grandis(l.)osbeck)为芸香科(rutaceae)柑橘属(citrus l.)植物。安江香柚品种中发现了红肉和芽变类型橘湘红，其果肉呈艳红色，晶莹透亮，肉质脆嫩，部分果实少核或无核的性状在果品上具备一定的潜在价值和市场竞争力。中国湖南农业大学已对变异株系持续关注和研究，发现“橘湘红”在不同年份稳定的出现少核性状，大多无核，果肉红色，暂名“橘湘红”并获得品种保护(品种权号cna20140106.3)。品种的优质与保护是市场持续发展的核心，因此，用于真实性鉴定的引物，可为品种保护与维权提供支持。

2、品种鉴定在植物育种和农业生产等方面具有重要意义，是保护植物品种权、防止假冒劣质品种进入市场的重要手段。分子标记(molecular markers)鉴定法从dna水平揭示了基因组结构和排列的特点及碱基序列差异，检测位点数量多，稳定性和可靠性较好分子标记是根据个体或种群间的核苷酸序列的差异作为遗传标记，直观明了地从dna水平上反映出生物的多样性。

3、基因组结构性变异(structure variation，sv)通常指基因组上大长度的序列变化和位置关系变化。其种类包括长度在50bp以上的长片段序列插入或者删除(big indel)、串联重复(tandem repeats)、染色体倒位(inversion)、染色体内部或染色体之间的序列易位(translocation)、拷贝数变异(copy number variations，cnv)以及形式更为复杂的嵌合性变异，在长度、来源、功能、影响上区别于其它类型的变异，sv可以检测出基因组上多至几千个碱基的结构变异，而且标记呈共显性遗传，重复性和稳定性好。

4、因此，需要寻求一种有效的方法对橘湘红品种进行真实性鉴定。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的上述技术问题之一，本发明提供了一种鉴定橘湘红品种的sv分子标记及其应用，以及提供了一种基于sv分子标记鉴定橘湘红品种的方法，使用两种生物信息学方法(svim-asm方法和minigraph方法)挖掘sv分子标记位点，通过核心引物与扩展引物的排列组合，可以有效鉴定是否为橘湘红品种，为橘湘红品种保护和快速真实性鉴定提供了有效方法。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下。

3、第一方面，本发明提供一种用于鉴定橘湘红品种的结构变异组合(sv分子标记)，包括分别位于2、3、4、7、9号染色体上的12个结构变异标记，标记引物序列分别如seq idno:1-12所示。

4、第二方面，本发明提供一种鉴定橘湘红品种的方法，包括检测所述12个结构变异标记组合对应的pcr扩增产物的步骤。

5、在一些实施方案中，用于扩增所述12个结构变异位点的引物对分别为引物对1-12，序列分别如seq id no:1和2、3和4、5和6、7和8、9和10、11和12、13和14、15和16、17和18、19和20、21和22、23和24所示。

6、在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：

7、s1：从所述橘湘红品种提取基因组dna；

8、s2：使用所述引物对分别对所述基因组dna进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；

9、s3：将所述pcr扩增产物分别进行电泳观察带型；

10、s4：根据电泳带型分别对pcr扩增产物进行赋值并依次排列，组合成品种编码，所述品种编码即可作为所述橘湘红品种的鉴定标记。

11、在一些实施方案中，步骤s4包括：选择变化范围为100-1000bp，将各扩增条带按大小进行排序，相差小于50bp视为同样大小条带，进行合并处理，大于50bp的为不同条带，进行赋值并编码。

12、第三方面，本发明提供所述结构变异组合在橘湘红品种育种中的应用。

13、第四方面，本发明提供所述结构变异组合在橘湘红品种鉴定中的应用。

14、在一些实施方案中，所述结构变异组合在包括宽皮柑橘类、橙类、柚类的品种中鉴定橘湘红品种的应用。

15、在一些实施方案中，所述结构变异组合在包括黄金蜜柚、强德勒、三红蜜柚、红肉蜜柚、琯溪蜜柚、安江早香柚、橘湘红、金兰柚、马家柚、沙田柚、泰国红宝石青柚、雷公1号、雷公2号和雷公柑的品种中鉴定橘湘红品种的应用。

16、第五方面，本发明提供一种用于橘湘红品种鉴定的试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的结构变异组合。

17、第六方面，本发明提供所述的结构变异组合或所述的试剂盒在构建橘湘红分子身份证中的应用。

18、第七方面，本发明提供所述结构变异组合的引物的筛选方法，包括如下步骤：

19、采用svim-asm软件将不同柑橘基因组与参考基因组做对比寻找出柚类品种核心引物的sv标记位点；开发并设计minigraph库整合所有柚类的变异位点来寻找橘湘红扩展引物的sv标记位点，利用推广性更强、操作更简单的琼脂糖凝胶电泳初筛和复筛，比对maker做电子pcr预测的准确度，最后选定多态性强、条带清晰、稳定性高的引物，得到3对核心引物和9对扩展引物。

20、核心引物仅在柚类中独有，本发明通过核心引物与扩展引物的组合，为橘湘红品种真实性鉴定提供依据。

21、在一些实施方案中，本发明所述结构变异组合的引物的筛选方法包括如下步骤：

22、1.采用svim-asm方法开发用于核心引物的结构变异位点，其中，收集ncbi中已公布全基因组信息的柑橘基因组21个，基于组装后的基因组与参考基因组甜橙进行全基因组比对结果进行sv位点的挖掘。

23、核心引物的开发用到的结构变异位点鉴定方法主要是svim-asm方法，svim-asm是基于组装后的基因组与参考基因组进行全基因组比对结果进行sv鉴定，相对于基于reads预测的sv特异性更高，核心引物用以将柚类从柑橘的其他大类中区分出来。

24、2.采用minigraph方法开发用于扩展引物的结构变异位点。扩展引物的开发用到的结构变异位点鉴定方法是minigraph方法，基于minigraph方法挖掘sv位点；相对于svim-asm方法，minigraph是基于图论方法首先将多个基因组建立泛基因组图，对于没有变异的区域在图上显示共用的线，有变异的区域显示进行分叉，minigraph同时对多个柚类基因组构建graph，根据新的基因组，可随时更新现有的graph而不需要重新构建graph，minigraph适合扩展引物这种较大规模的泛基因组结构变异鉴定。

25、3.针对前面鉴定出来的结构变异位点，提取sv位点序列信息，在位点上下游区域设计引物。

26、4.用ispcr对每对引物在各柑橘品种基因组中进行电子pcr扩增。

27、5.选择品种间变异较大的位点作为候选验证位点。

28、6.利用琼脂糖凝胶电泳进行引物筛选，选择多态性强、条带清晰、稳定性高的引物。

29、7.得到3对核心引物与9对扩展引物，将上述引物组合，形成可以用于橘湘红真实性鉴定的引物组合。

30、本发明建立一种基于结构变异组合的橘湘红真实性鉴定方法，通过琼脂糖电泳筛选得到3对核心引物和9对扩展引物。其中，核心引物在柑、橘、橙、柚四个大类间具有区分，扩展引物是在柚类品种间具有特异差异的引物。在开发引物时，先选取不同的柑橘大类进行引物设计，之后再通过用四大类的代表品种将具有大类区分性的引物扩充验证后记为核心引物；扩展引物同理(在不同的柚类间进行设计)。通过将上述得到的3对核心引物和9对扩展引物组合，形成可以用于橘湘红真实性鉴定的引物组合。

31、本发明的有益效果至少包括以下之一：

32、本发明的基于sv分子标记鉴定橘湘红品种的方法，使用两种生物信息学方法挖掘sv分子标记位点，通过核心引物与扩展引物的排列组合，可以有效鉴定是否为橘湘红品种，为橘湘红品种保护和快速真实性鉴定提供了有效方法。