一种烟草蔗糖酯类提取物及制备方法与应用

本发明属于植物天然产物开发与利用领域，具体涉及一种烟草资源(nicotianaglutinosa)蔗糖酯类化合物的提取、分离方法及在防治作物真菌病、病毒病及卷烟提质中的应用。

背景技术：

1、蔗糖酯是蔗糖与各种酸基结合而成的一大类有机化合物的总称，因其具有无毒、易生物降解及良好的表面性能，广泛应用于食品、医药、化妆品等领域，是推荐使用的食品添加剂。蔗糖酯的研究和应用一直是受到国内外关注。

2、烟草植株表面密被腺毛，糖酯是烟草腺毛分泌成分的主要成分之一。烟草中的糖酯主要是蔗糖四元酯，也有少量葡萄糖四元酯。severson从n.gossei提取了25种糖酯成分，利用多种革兰氏阳性菌进行抑菌试验，发现乙酰基连在蔗糖酯母环c7、c8上的糖酯复合物比连接在c5、c6上的抑菌活性更高。kennedy从n.gossei.n.acuminata，n.attenuata等九种烟草烟叶中提取的糖酯组分均能抑制黄瓜炭疽病菌的孢子生长，而从n.gossei中提取的糖酯组分效果最好，ic50可达到1.2ug/cm2。furukawa等人通过扫描电镜和sds-page发现糖酯类化合物通过改变细菌细胞膜和细胞转运蛋白质的通透性，来抑制细菌生长。糖酯类化合物对于昆虫，具有一定的接触毒性，可使昆虫的皮膜脱落，脱水干瘪死亡。severson等人从n.gossei中提取的糖酯组分，对梨黄木虱成虫有较好的防控作用；对蚜虫显示出良好的杀灭作用，并在湿度合适的情况下，呈现量效关系。chortyl等人研究了不同类型烟草的se对一些害虫的毒性，发现n.gossei的se对温室粉虱和蜘蛛螨成虫杀灭活性最高，其致死率可达到100％，其它品种烟草se的杀虫活性相对较低。而n.gossei的蔗糖酯特点在于：其部分酰基所带支链较长，如甲基-己酰基、甲基-庚酰基，而其他品种蔗糖酯所带支链较短。

3、烟草糖酯在热裂解过程中，糖酯的酰基部分会降解产生挥发性有机酸，很多产生的挥发性有机酸就与卷烟香味有关。schmacherjn利用香料烟提取葡萄糖四酯，然后添加到卷烟中，研究结果表明，葡萄糖四酯裂解后，产生的脂肪酸明显提高了卷烟烟气中脂肪酸香味物质的含量，卷烟的吸味口感和香气品质得到显著改善。但不同类型的烟草蔗糖酯，由于其酰基结合位置及脂肪酸链的长短及结构存在差异，在卷烟燃烧过程裂解产物也存在差异，对卷烟香吃味品质的影响也存在差异，severson将从t.i.65中分离得到的se加入卷烟中，添加量0.37-0.75mg/支时，烟气具有强烈的油腻味，添加量为3.0-5.omg/支时，烟气则呈轻微的热蜡味。

4、粘烟草(nicotiana glutinosa)为烟草白粉病和烟草花叶病毒的抗性种质资源。arrenedale等人参考severson等的方法，分离粘烟草表面蔗糖酯，用ch2cl2浸渍烟草叶片，浸提液经无水na2so4干燥和旋转蒸发器浓缩后，用meoh-h2o溶解，加入正己烷分层，弃去正己烷相，最后再向meoh-h2o相中加入chcl3、饱和kcl溶液、水，充分振荡，分层后将chcl3相转入交联葡聚糖sephadex lh-20凝胶层析柱中，用ch2cl2进行淋洗，最后分离出糖酯同系物，首次发现粘烟草存在两类蔗糖酯，一类果糖环上存在乙酰基，另一类没有乙酰基。jackson等人的研究表明，包括粘烟草在内的多种烟草品种中提取的蔗糖酯、葡萄糖酯类物质能刺激烟草蚜虫(tabacco budworm)产卵，但是相比于普通烟草，粘烟草植株上烟蚜夜蛾(h.virescens)幼虫的生存率和发育率都比较低，这可能与粘烟草表面或叶片内的化学成分有很大关系。

5、综合以上研究看出，有关烟草蔗糖酯抗虫及抑制细菌活性研究较多，抑制真菌活性的研究较少，且蔗糖酯抗虫、抑菌活性与其化学结构有关，不同结构蔗糖酯其生物活性存在较大差异。目前有关粘烟草蔗糖酯抑菌、抗病毒活性研究还未见报道，粘烟草由两种类型的蔗糖酯组成，不同类型蔗糖酯生物活性特征也未见报道。粘烟草蔗糖酯在卷烟加香中的应用效果也未见报道。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种烟草蔗糖酯类提取物及制备方法与应用。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种烟草蔗糖酯类提取物，所述提取物为fractionⅰ，结构式如下所示：

4、

5、一种烟草蔗糖酯类提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

6、1)原料选择：以粘烟草(nicotiana glutinosa)叶片或花序作为蔗糖酯提取原料，可以使用新鲜或干燥后叶片或花序作为蔗糖酯提取原料；

7、2)蔗糖酯提取：以95％以上乙醇作为提取溶剂，液料质量比10-15:1，常温喷淋提取，连续提取2-3次，每次3-5min，将提取液合并，50℃减压浓缩除去溶剂，获得粘烟草(nicotianaglutinosa)蔗糖酯粗提物浸膏；

8、3)柱层析纯化：

9、以粘烟草(nicotiana glutinosa)蔗糖酯粗提物浸膏为原料，以硅胶为柱层析材料，以不同比例的石油醚、乙酸乙酯、乙醇作为洗脱剂，通过柱层析分离富集蔗糖酯类化合物，获得纯化蔗糖酯混合物；

10、4)薄层层析分离不同结构的蔗糖酯：

11、将以上获得的纯化后的蔗糖酯为原料，以薄层层析硅胶(gf254)为吸附层，使用二氯甲烷：甲醇(10:1)+3‰的冰醋酸的为展开体系，分离不同结果的粘烟草蔗糖酯。

12、进一步的，步骤3)所述柱层析纯化包括：

13、取蔗糖酯粗提物浸膏，用无水乙醇溶解，以质量比原料：拌样硅胶＝1:1.2拌样，晾干，除去有机溶剂后，将伴有硅胶的蔗糖酯粗提物，均匀装入直径8cm预先装有300g洗脱硅胶的减压抽滤砂芯层析柱上层，依次用12倍(v/m，ml/g)粗提物浸膏质量的以下溶剂进行洗脱，100％石油醚(fr1)、80％石油醚+20％乙酸乙酯(fr2)、40％石油醚+60％乙酸乙(fr3)、20％石油醚+60％乙酸乙酯(fr4)、100％乙酸乙酯(fr5)、80％乙酸乙酯+20％乙醇(fr6)、40％乙酸乙酯+60％乙醇(fr7)、20％乙酸乙酯+80％乙醇(fr8)、100％乙醇(fr9)，收集各洗脱组分，分别取以上各洗脱组分1ml，氮吹至干；

14、将含有蔗糖酯的fr4\fr5\fr6\fr7洗脱组分混合，50℃减压浓缩除去有机溶剂，获得纯化蔗糖酯混合物。

15、进一步的，所述拌样硅胶100-200目，国药cas112926-00-，货号20034371；

16、所述洗脱硅胶200-300目，国药，cas112926-00-，货号20034365。

17、进一步的，步骤4)薄层层析包括：

18、称取500g薄层色谱专用gf254型硅胶，与0.4％的羧甲基纤维素钠(用沸水溶解)混合均匀，混合溶液倾倒于玻璃板上，制备硅胶板；

19、纯化蔗糖酯混合物用二氯甲烷与甲醇混合溶液(1：1)溶解，配制成10％的溶液，反复均匀点样于点样基线上，每薄层制备板点样量80mg；

20、在基线右侧对照显色点处点样4-5次，用于样品展开后的显色；

21、在展开缸中加入70ml展开剂，密闭，保持15min，放入载有样品的薄层板，密闭，待展开剂沿线到达板最上端10mm时取出，通风橱晾干；

22、吸取1ml茴香醛-硫酸显色剂均匀的加在薄层板右侧对照显色样点展开部分，利用高温电吹风加热，至样品显色，显色带出现2个黑色样点；

23、将显色后薄层制备板置于紫外254nm下，制备板显示两条荧光带，上部黑色蔗糖酯对照样点位于两条荧光带之间，下部黑色蔗糖酯对照点位于靠近点样带的荧光带的下方，结合荧光带与黑色对照点区域位置，刮板回收2个黑色显色区域对应的蔗糖酯样品；

24、分别使用洗脱剂洗脱，过滤除去吸附剂，收集洗脱液，减压蒸干除去溶剂，分别获得分离纯化后的蔗糖酯组分；

25、薄层板上、下部黑色显色区域分离获得的蔗糖酯组分分别为蔗糖酯类fractioni、蔗糖酯类fraction ii。

26、进一步的，所述展开剂为体积比二氯甲烷：甲醇＝10:1，混合后加入体积分数3‰的冰醋酸混合；

27、所述洗脱剂为体积比甲醇：二氯甲烷＝1:1混合。

28、一种烟草蔗糖酯类提取物在抑菌或抗病毒中的应用。

29、一种烟草蔗糖酯类提取物在烟草制品增香中的应用。

30、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果为：

31、本发明以粘烟草(nicotianaglutinosa)为原料提取蔗糖酯，用于生物农药，一方面具有生物产量高，提取技术简单，生产成本低的特点，另一方面，可以克服化学防治作物病害导致的3r问题。

32、本发明以粘烟草(nicotianaglutinosa)为原料提取蔗糖酯，用于卷烟加香，具有生产成本低，用量小，效果显著的特点。

33、本发明首次证明粘烟草蔗糖酯果糖环的c3位置乙酰基为其抑菌活性的主要基团，并首次发现其具有良好的抗病毒活性。一方面为植物源蔗糖酯绿色杀菌剂、抗病毒剂提取与利用提供资源材料，另一方面为蔗糖酯类绿色杀菌剂的化学与生物合成提供了化合物模板。