TaCRT3蛋白在调控小麦抽穗期中的应用

本发明涉及生物中，tacrt3蛋白在调控小麦抽穗期中的应用。

背景技术：

1、普通小麦(triticumaestivuml.,aabbdd)是全球最重要的粮食作物之一，为不同地区的人们提供大量的碳水化合物和蛋白质，养活了世界上约40％的人口。小麦最早起源于西亚的新月沃地(fertile crescent)，因其极强的环境适应能力，迅速扩大到全球各地，成为全世界种植范围最广的作物。抽穗期/开花期是判定小麦生态适应性最为重要的农艺性状之一，对小麦的产量、品质、抗逆性等都有重要影响，因此，关于小麦抽穗期/开花期的研究一直是国际小麦领域研究的焦点和热点。然而，抽穗期/开花期是受多基因调控的复杂数量性状，目前小麦抽穗期主要集中在对春化基因(vrn)和光周期反应基因(ppd)的研究。研究表明，vrn的变异赋予小麦春冬性，ppd变异使得小麦可以适应不同地区的日照长度和光照强度，因此，调控小麦抽穗/开花主效基因的重要变异决定了小麦的区域分布及对大生态区的适应性。

2、然而，由于小麦是异源六倍体作物，基因组庞大且复杂，参考基因组释放较晚，使得小麦抽穗期/开花期功能基因鉴定及分子机理解析比较滞后。因此，发掘新的调控小麦抽穗期/开花期的功能基因，阐明其分子机制并构建系统的抽穗/开花调控网络，对于广适小麦品种分子设计育种具有重要的科学意义和应用价值。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何调控植物抽穗期。

2、为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质或调控所述蛋白质含量或活性的物质的下述任一应用：

3、d1)调控植物抽穗期；

4、d2)制备调控植物抽穗期产品；

5、d3)培育抽穗期缩短或增加植物；

6、d4)制备培育抽穗期缩短或增加植物产品；

7、所述蛋白质为如下a1)、a2)或a3)：

8、a1)氨基酸序列是seq id no.4或seq id no.2的蛋白质；

9、a2)将序列表中seq id no.4或seq id no.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

10、a3)在a1)或a2)的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质。

11、上述a2)中的蛋白质，为与seq id no.4或seq id no.2所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

12、上述a2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

13、上述a2)中的蛋白质的编码基因可通过将seq id no.3或seq id no.1所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，seq id no.3所示的dna分子编码seq id no.4所示蛋白质，seq id no.1所示的dna分子编码seq id no.2所示蛋白质。

14、a3)中所述标签可为poly-arg、poly-his、flag、strep-tag ii、c-myc等。

15、上述应用中，所述物质可为下述b1)至b9)中的任一种：

16、b1)编码所述蛋白质的核酸分子；

17、b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；

18、b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；

19、b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；

20、b5)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

21、b6)含有b1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有b2)所述表达盒的转基因植物组织；

22、b7)含有b1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有b2)所述表达盒的转基因植物器官；

23、b8)降低所述蛋白质含量的核酸分子；

24、b9)含有b8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。

25、上述应用中，b1)所述核酸分子可为如下b11)或b12)或b13)或b14)：

26、b11)编码序列是序列表中seq id no.3或seq id no.1的dna分子；

27、b12)序列表中序列表中seq id no.3或seq id no.1所示的dna分子；

28、b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质的dna分子；

29、b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质的dna分子。

30、本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码本发明的蛋白质且具有相同的蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

31、这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码seq id no.4或seq id no.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

32、上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5mnapo4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，2×ssc，0.1％ sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m napo4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，1×ssc，0.1％ sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m napo4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m napo4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×ssc，0.1％ sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m napo4和1mm edta的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×ssc，0.1％ sds中漂洗；也可为：在6×ssc，0.5％ sds的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×ssc,0.1％ sds和1×ssc,0.1％sds各洗膜一次；也可为：2×ssc，0.1％ sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％ sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×sspe(或0.1×ssc)、0.1％sds的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

33、上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

34、上述应用中，b2)所述的含有编码所述蛋白质的核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达所述蛋白质的dna，该dna不但可包括启动所述蛋白质编码基因转录的启动子，还可包括终止所述蛋白质编码基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

35、b2)所述表达可为如下b11)或b12)或b13)：

36、b21)序列表中seq id no.5的第17-7239位或seq id no.6的第1-5858位所示的dna分子；

37、b22)与b21)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的dna分子；

38、b23)在严格条件下与b21)或b22)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的dna分子。

39、可用现有的表达载体构建含有所述rh1基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pahc25、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa、psn1301或pcambia1391-xb(cambia公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptii基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的epsps基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

40、上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pcambia3301载体。

41、b3)所述重组表达载体具体可为pcambia3301-ptacrt3::tacrt3或

42、pcambia3301-pubi::tacrt3。pcambia3301-ptacrt3::tacrt3重组载体通过将tacrt3表达盒(ptacrt3::tacrt3)(seq id no.5的第17-7239位)插入至载体的ecori和pmli之间得到。pcambia3301-pubi::tacrt3重组载体通过将tacrt3基因(seq id no.6的第2009-5858位)插入至载体的bamhi和pml i之间得到。

43、上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌。

44、上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

45、上述应用中，所述植物可为m1)或m2)或m3)：

46、m1)单子叶植物或双子叶植物；

47、m2)禾本科植物；

48、m3)小麦。

49、本发明还提供了下述任一方法：

50、x1)培育抽穗期延长植物的方法，包括使受体植物中表达seq id no.4所示蛋白质，或提高受体植物中seq id no.4所示蛋白质的含量或活性，得到抽穗期延长的目的植物；

51、x2)延长植物抽穗期的方法，包括使受体植物中表达seq id no.4所示蛋白质，或提高受体植物中seq id no.4所示蛋白质的含量或活性，得到抽穗期延长的目的植物，实现植物抽穗期的延长；

52、x3)培育抽穗期延长植物的方法，包括降低受体植物中seq id no.2所示蛋白质的含量或活性，或敲除seq id no.2所示蛋白质的编码基因，得到抽穗期延长的目的植物；

53、x4)延长植物抽穗期的方法，包括降低受体植物中seq id no.2所示蛋白质的含量或活性，或敲除seq id no.2所示蛋白质的编码基因，得到抽穗期延长的目的植物，实现植物抽穗期的延长；

54、x5)培育抽穗期缩短植物的方法，包括使受体植物中表达seq id no.2所示蛋白质，或提高受体植物中seq id no.2所示蛋白质的含量或活性，得到抽穗期缩短的目的植物；

55、x6)缩短植物抽穗期的方法，包括使受体植物中表达seq id no.2所示蛋白质，或提高受体植物中seq id no.2所示蛋白质的含量或活性，得到抽穗期缩短的目的植物，实现植物抽穗期的缩短。

56、上述方法中，x1)与x2)所述方法可通过向所述受体植物中导入seq id no.4所示蛋白质的编码基因并使所述编码基因得到表达实现；

57、x5)与x6)所述方法可通过向所述受体植物中导入seq id no.2所示蛋白质的编码基因并使所述编码基因得到表达实现。

58、上述方法中，所述植物可为m1)或m2)或m3)：

59、m1)单子叶植物或双子叶植物；

60、m2)禾本科植物；

61、m3)小麦。

62、所述蛋白质，也属于本发明的保护范围。

63、所述调控所述蛋白质含量或活性的物质，也属于本发明的保护范围。

64、上述方法中，所述编码基因可为b1)所述核酸分子。

65、上述方法中，其中所述编码基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：

66、1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述蛋白质的编码基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的gc含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中gc含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

67、2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

68、3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

69、4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于camv的tml，来源于rbcs的e9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

70、5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于tmv,mcmv和amv)。

71、所述蛋白质的编码基因可利用含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入受体植物。所述重组表达载体具体可为pcambia3301-ptacrt3::tacrt3或

72、pcambia3301-pubi::tacrt3。

73、所述重组表达载体可通过使用ti质粒，植物病毒载体，直接dna转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(weissbach,1998，method for plant molecularbiology viii,academy press,new york,pp.411-463；geiserson and corey,1998,plantmolecular biology(2nd edition).)。

74、所述目的植物理解为不仅包含所述蛋白质或其编码基因被改变的第一代植物，也包括其子代。对于所述目的植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述目的植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

75、实验证明，本发明的蛋白质及其编码基因可以调控植物的抽穗期。

76、下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。