一种高灵敏高特异性检测铀离子的生物传感器

本发明属分析检测，具体涉及一种高灵敏高特异性检测铀离子的生物传感器。

背景技术：

1、铀离子(uo22+)具有放射性和富集性，是一种可用于指示核泄漏和放射性核物质排放的重金属，严重危害环境安全和人体健康。对铀离子的检测具有重要意义。

2、目前，实验室中最常用的铀离子探测方法主要包括：原子吸收光谱(aas)、电感耦合等离子体原子发射光谱(icp-aes)和电感耦合等离子体质谱(icp-ms)，这些方法具有高选择性、高灵敏度的特点。然而，现有方法存在分析成本高、设备造价昂贵、仪器笨重等缺陷。生物传感器通常采用dna为分子识别元件，通过dna识别与信号转换，实现简单快速检测目标物的目的。已报道的传感器用于铀离子检测常面临灵敏度不足和特异性差的问题，难以满足对痕量铀离子的检测需求。

3、因此，目前迫切需要构建一种操作便捷、灵敏度高、特异性好、准确度高的生物传感器，以实现对环境中铀的检测与预警。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种高灵敏检测铀离子的生物传感器及其应用，该生物传感器基于dna1探针、dna2探针、dna3探针和dna4探针实现了铀离子的快速检测，能够快速检测样品中的铀离子，具有较好的精确度和可靠性。

2、本发明第一方面的目的，在于提供一种铀离子的检测试剂。

3、本发明第二方面的目的，在于提供本发明第一方面的一种检测试剂在制备检测铀离子的产品中的应用。

4、本发明第三方面的目的，在于提供一种生物传感器。

5、本发明第四方面的目的，在于提供本发明第一方面的检测试剂或本发明第三方面的生物传感器在检测铀离子中的应用。

6、本发明第五方面的目的，在于提供一种铀离子的检测方法。

7、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

8、本发明的第一个方面，提供一种铀离子的检测试剂，包括dna1探针、dna2探针、dna3探针和dna4探针；其中，

9、所述dna1探针中含有特异性识别铀离子的核酸核酶、互补序列1和互补序列2；

10、所述dna2探针中含有互补序列a、互补序列b和互补序列c；

11、所述dna3探针中含有互补序列3；

12、所述dna4探针中含有互补序列b*和互补序列c*；

13、所述互补序列1与所述互补序列a中的部分碱基互补配对；

14、所述互补序列2与所述互补序列b中的部分碱基互补配对；

15、所述互补序列3与所述互补序列b*中的碱基互补配对；

16、所述互补序列b与所述互补序列b*中的碱基互补配对；

17、所述互补序列c与所述互补序列c*中的碱基互补配对。

18、在本发明一些实施方式中，所述互补序列1为dna1探针中第1～9位碱基组成的核苷酸序列。

19、在本发明一些实施方式中，所述互补序列2为dna1探针中第40～48位碱基组成的核苷酸序列。

20、在本发明一些实施方式中，所述互补序列a为dna2探针中第55～66位碱基组成的核苷酸序列。

21、在本发明一些实施方式中，所述互补序列b为dna2探针中第41～53位碱基组成的核苷酸序列。

22、在本发明一些实施方式中，所述互补序列c为dna2探针中第1～10位碱基组成的核苷酸序列。

23、在本发明一些实施方式中，所述互补序列b*为dna4探针中第1～13位碱基组成的核苷酸序列。

24、在本发明一些实施方式中，所述互补序列c为dna4探针中第14～23位碱基组成的核苷酸序列。

25、在本发明一些实施方式中，所述dna1探针、dna2探针、dna3探针和dna4探针的核苷酸序列分别为：

26、dna1探针：

27、5’-tccatctctgcagtcgggtagttaaaccgaccttcagacatagtgagt-3’

28、(seq id no:1)；

29、dna2探针：

30、5’-tcttcctatgatcagactgatgcaaagtcatcagtctgatacgcactcactatraggaagagatgga-3’(seq id no:2)；

31、dna3探针：5’-acgcactcactat-3’(seq id no:3)；

32、dna4探针：5’-atagtgagtgcgtcataggaaga-3’(seq id no:4)；

33、其中，所述dna2探针的核苷酸序列中的ra代表腺嘌呤核糖核苷酸。

34、在本发明一些实施方式中，所述dna2探针的核苷酸序列中的ra为切割位点。

35、在本发明一些实施方式中，所述dna3探针和dna4探针的核苷酸序列中的其中一条修饰有淬灭基团，另一条修饰有荧光基团。

36、在本发明一些实施方式中，所述淬灭基团修饰于dna3探针的核苷酸序列的3’端。

37、在本发明一些实施方式中，所述淬灭基团为bhq。

38、在本发明一些实施方式中，所述荧光基团修饰于dna4探针的核苷酸序列的5’端。

39、在本发明一些实施例中，所述荧光基团为fam。

40、在本发明中，本领域技术人员可以根据实际使用需求，将荧光基团fam和淬灭基团bhq合理替换为其他荧光基团和淬灭基团，以实现荧光标记的效果。

41、本发明的第二个方面，提供本发明第一方面的检测试剂在制备检测铀离子的产品中的应用。

42、在本发明一些实施方式中，所述产品中还含有缓冲液。

43、本发明的第三个方面，提供一种包括本发明第一方面的检测试剂的生物传感器。

44、本发明的第四个方面，提供本发明第一方面的检测试剂或本发明第三方面的生物传感器在检测铀离子中的应用。

45、本发明的第五个方面，提供一种铀离子的检测方法，包括使用本发明第一方面的检测试剂或本发明第三方面的生物传感器对待测样品进行检测的步骤。

46、在本发明一些实施方式中，所述检测方法包括以下步骤：

47、将所述dna3探针和dna4探针混合，反应，得到dna3-dna4混合物；

48、将所述dna1探针、dna2探针和待测样品混合，第一次反应；与dna3-dna4混合物混合，再次反应，检测荧光强度。

49、在本发明一些实施方式中，所述dna1探针、dna2探针、dna3探针和dna4探针的摩尔浓度比为3:4～5:3～4:4～5。

50、在本发明一些实施方式中，所述dna1探针、dna2探针、dna3探针和dna4探针在反应体系中的终浓度分别为dna1:150nm；dna2：200nm；dna3:200nm；dna4:200nm。

51、在本发明一些实施方式中，所述dna3探针和dna4探针混合反应的条件为：在缓冲液(50mm mes缓冲液，包含150mm nano3，ph为6.5)中混合，200nm的dna3和200nm的dna4混匀，即得到400nm的dna3-dna4复合物。

52、在本发明一些实施方式中，所述第一次反应的条件为室温反应50～70min。

53、在本发明一些优选实施方式中，所述第一次反应的条件为室温反应50～60min。

54、在本发明一些实施方式中，所述再次反应的条件为室温反应20～50min。

55、在本发明一些优选实施方式中，所述再次反应的条件为室温反应20～30min。

56、在本发明一些实施方式中，所述检测体系中还包括缓冲液。

57、在本发明一些实施方式中，所述缓冲液包括mes缓冲液。

58、在本发明一些实施方式中，所述缓冲液的mes浓度为40～60mm。

59、在本发明一些实施方式中，所述缓冲液的ph值为5.0～7.5。

60、在本发明一些实施方式中，所述缓冲液中含有终浓度为120～160mm的nano3。

61、在本发明一些实施方式中，所述待测样品包括但不限于土壤、矿石、废水。

62、所述检测方法的检测原理为：

63、在本发明中，构建生物传感器所需的四条dna探针分别是：dna1，dna2，dna3和dna4。其中，dna1是能够特异性识别铀离子的核酸核酶(dnazyme)的酶链探针。dna2是一种含有两个环的发夹结构探针，其中红色标记部分为核酸核酶(dnazyme)的底物链探针，蓝色圆点为切割位点(ra)。dna3的一端修饰淬灭基团bhq。dna4的一端修饰荧光基团fam。dna3和dna4的b*部分互补，形成dna3-dna4复合物，此时淬灭基团bhq和荧光基团fam靠近，fam荧光被淬灭，反应体系中只有很低的背景荧光信号。

64、当反应体系中有铀离子存在时，dna1的左臂会与dna2的a区域结合，从而打开dna2上先前互补的c区域，并暴露b区域。此时，dna1的右臂会与dna2的b区域结合，使双环dna2变成单环dna2。随后铀离子会在dna2的切割位点(蓝色标记部分，ra)切割dna2，从而释放dna2的a区域。dna1也会自动释放，进入下一轮的循环。同时铀离子在完成切割反应后也会自动释放，进入下一轮的循环。从而形成自动循环反应过程。

65、经过不断地循环切割反应，双环dna2变成单环dna2，并且使c区域和b区域暴露在外。此时dna2的c区域能与dna4中的c区域互补，从而启动链置换反应，把dna3置换下来，形成dna2-dna4复合物。从而使bhq远离fam，产生较强的荧光信号，检测体系中的荧光强度。

66、荧光检测反应完后的溶液，激发峰是495nm，发射峰是525nm；荧光强度与uo22+的浓度具有正相关性，从而实现对铀离子的检测。

67、本发明的有益效果是：

68、在本发明中，由四种核酸探针dna1、dna2、dna3和dna4构建成铀离子生物传感器，当反应体系中存在铀离子时，可自动发生切割反应，无需外部刺激，并可循环多次反应，从而实现检测信号的放大。在形成的dna2-dna4反应物中，由于荧光基团和淬灭基团的分离，实现荧光信号的增强，从而达到对铀离子的定量检测。该荧光生物传感器灵敏度高，其对铀离子的检测限可达到2pm，能满足痕量铀离子检测需求。同时该生物传感器具有很好的特异性，其他重金属离子不会干扰检测结果，抗干扰能力强。在本发明中构建的荧光生物传感器可为铀离子的高灵敏、高特异性检测提供一种新方法。

69、构建的自动化循环生物传感器无需蛋白酶、抗体、纳米材料，无需大型仪器，极大节约了成本，简化了操作，以纯dna进行组装，提高了生物传感器的稳定性和可靠性。