花花柴KcHTR3基因在提高生物体环境胁迫抗性中的应用

本发明涉及分子生物学育种，特别涉及一种花花柴kchtr3基因在提高生物体环境胁迫抗性中的应用。

背景技术：

1、非生物因子是决定植物分布和生产力高低的环境基本组成部分。在自然界中，植物常常不断受到不利的非生物环境的挑战，如极端温度、盐碱、干旱、渗透等胁迫，这些非生物胁迫在一定程度上对农作物的生产产生了巨大的负面影响，并限制了全球可栽培耕地的利用。由于全球气候变化，极端温度频繁发生，温度胁迫已经成为作物生产的主要威胁之一。高温胁迫影响着植物的所有生长阶段，尤其是在授粉阶段，高温会破坏花粉、雄蕊和受精之间的相互作用，从而导致植株结实率低，进一步导致作物产量大幅降低。霜冻、寒潮等低温胁迫是出现于早秋和晚春时节的主要气象灾害，植物在低温胁迫下将出现叶绿素合成受阻、光合酶以及参与细胞扩张和细胞分裂的酶活性受到抑制、细胞膜被破坏等生理生化变化，宏观表现为植株生长迟缓、苗弱、产量降低和品质下降，例如在温带地区，冷胁迫会导致水稻减产30％-40％；而且，低温胁迫(一般为0-12℃)限制了作物的地理分布，致使多数植物无法正常生长在寒冷地区。因此，了解并研究植物如何感知外界环境变化所带来的非生物胁迫信号并做出应激反应，保护自身免受环境恶化的影响，对有效利用有限的耕地资源和解决粮食和生态安全等问题尤为重要。

2、生物对极端温度胁迫是一个复杂的生理过程，包含信号感受系统、信号传导系统、受体蛋白激活、抗性基因激活等一系列过程，涉及多基因参与。目前人们已经从植物中分离、克隆了多种逆境胁迫相关的基因，例如，高温胁迫可被一些热休克蛋白(hsps)基因感知，另外，植物激素可以调节植物生命周期中发生的各种生理过程，脱落酸、水杨酸、茉莉酸、乙烯等多种植物激素在植物生长和热应激反应中起着关键作用，高温胁迫下前述基因表达活跃。在一些寒冷地区，植物已经进化出克服低温胁迫影响的响应机制，目前已有研究发现，钙信号、活性氧、硫化氢、环鸟苷单磷酸、卵磷脂和鞘脂等小分子物质在细胞信号转导中起至关重要的作用，cbf(c-repeat(crt)-binding factors)依赖的信号途径是植物低温信号转导中典型的转录调控通路；植物首先通过细胞膜的流动性变化和细胞骨架的重排来感知温度的波动，随后导致钙离子内流，激活钙离子信号途径和ice1(inducerof cbfexpression 1)-cbf-寒冷响应途径，并调节下游cbf家族基因的表达，表达产物结合到多种寒冷和脱水应答基因，最终使植物获得低温耐受能力。

3、目前，已有通过利用特异性响应环境胁迫下的基因赋予植物抗环境变化的技术，然而即使已知在相当于环境胁迫的条件下该基因特异性地高表达，以高表达该基因的转基因植物也未必能够获得环境胁迫抗性，因此，现如今发现的大多数环境胁迫响应基因均难以实际应用于种质资源创新。开发并利用新的耐极端温度的植物资源及基因资源仍是未来缓解由温度变化导致的植物生长发育受阻及产量下降的主要研究方向。另外，植物是固着性生物，其在同一种植区域受干旱、盐碱、高温热害、低温冷害的非生物胁迫情况时有发生，换言之，植物生长发育过程中需要能够应付多重环境胁迫，然而，现如今能够应用于种质创新的环境胁迫响应基因通常只能响应一种环境变化，导致其应用场景非常有限。

4、花花柴(karelinia caspica)是一种典型的具有广谱抗逆性的菊科荒漠植物(中国植物志，第七十五卷，科学出版社，1979年9月，第一版，p54-55)，具有耐极端温度、耐盐碱、耐干旱等广谱抗逆性，是极为宝贵的天然抗逆植物资源，其生长在戈壁、沙漠、高盐碱草甸等恶劣的环境中，常大片群生，在荒漠中极为常见，花花柴的叶片扁平且明显肉质化，体内有发达的储水组织，因此保水能力强，并具有较低的萎蔫系数。充分利用荒漠植物花花柴的植物资源，探索花花柴环境胁迫基因并加以功能验证，再应用于有经济价值的作物等，不仅可以为植物对环境响应的分子机理研究提供理论基础，也可以为耐环境胁迫作物育种提供新的种质资源和育种材料。

技术实现思路

1、针对现有技术中的上述技术问题，本发明从花花柴中发现了一种对15％聚乙二醇(peg)、400mmol/l nacl、45℃高温、4℃低温等环境因素胁迫均能够做出积极响应的kchtr3基因，基于其广谱抗逆性，提供了该基因在提高生物体环境胁迫抗性中的应用，过表达kchtr3基因的转基因生物体具有增强的对高温、低温和高盐胁迫的耐受性，有利于转基因生物体适应复杂多变的生境，在培育同时具有多种非生物胁迫抗逆性能力增强的植物和微生物品种方面具有很好的应用前景。

2、本发明具体通过以下技术方案实现：

3、本发明提供了花花柴kchtr3基因在提高生物体环境胁迫抗性中的应用，所述环境胁迫为高温胁迫、低温胁迫和盐胁迫中的至少一种，其中，所述花花柴kchtr3基因的cdna序列如seq id no.1所示，或者所述花花柴kchtr3基因编码的蛋白序列如seq id no.2所示。

4、进一步地，所述环境胁迫包括高温胁迫，所述高温胁迫的温度不高于45℃。

5、进一步地，所述环境胁迫包括低温胁迫，所述低温胁迫的温度不低于4℃。

6、进一步地，所述环境胁迫包括盐胁迫，所述盐胁迫的盐浓度为0-0.2m。

7、进一步地，所述应用包括以下步骤：构建kchtr3基因超表达载体，转化野生型生物体，培养获得kchtr3基因过表达的转基因生物体。

8、更进一步地，构建所述kchtr3基因超表达载体包括以下步骤：采用seq id no.5-6所示的引物对扩增kchtr3基因，将扩增得到的所述kchtr3基因通过bp-lr反应连接至植物表达载体pk2gw7上，得到kchtr3基因植物超表达载体；或者，采用seq id no.3-4所示的引物对扩增kchtr3基因，通过酶切酶连反应将扩增得到的所述kchtr3基因连接至原核表达载体pet-28a上，得到kchtr3基因微生物超表达载体。

9、再进一步地，所述kchtr3基因植物超表达载体的构建方法包括：采用seq idno.5-6所示的引物对扩增kchtr3基因，通过bp反应将扩增得到的所述kchtr3基因连接至pdonrtm221载体上，之后通过lr反应将所述pdonrtm221载体上的所述kchtr3基因产物连接至植物表达载体pk2gw7上，得到所述kchtr3基因植物超表达载体。

10、再进一步地，所述kchtr3基因微生物超表达载体的构建方法包括：采用seq idno.3-4所示的引物对扩增kchtr3基因，通过bam hⅰ和hindⅲ限制性内切酶对扩增得到的所述kchtr3基因和原核表达载体pet-28a进行双酶切反应，之后将双酶切产物利用t4 dna连接酶连接，得到所述kchtr3基因微生物超表达载体。

11、进一步地，将所述kchtr3基因超表达载体转化所述野生型生物体的方法选自ti质粒转化法、ri质粒转化法、病毒载体转化法、基因枪法、显微注射法、电穿孔法和农杆菌介导法中的一种。

12、进一步地，所述生物体为植物或微生物。

13、更进一步地，所述植物选自拟南芥、棉花、油菜、水稻、小麦、大豆和玉米中的至少一种，所述微生物选自细菌。

14、本发明的优点及积极效果为：

15、本发明研究发现荒漠植物花花柴kchtr3基因对干旱、15％聚乙二醇(peg)、400mmol/lnacl、45℃高温、4℃低温等环境因素胁迫均能够做出积极响应，基于其广谱抗逆性，将kchtr3基因在植物如拟南芥和细菌如大肠杆菌等中进行过表达，发现得到的转基因生物体在极端温度和高盐条件下的存活率明显高于未转化kchtr3基因组，证实kchtr3基因有助于改善生物体积极应对高温、低温或高盐胁迫的能力，能够增强生物体对高温、低温或高盐等环境因素的耐受性，有利于其适应复杂多变的生境，在培育同时具有多种非生物胁迫抗逆性能力增强的植物和微生物品种方面具有很好的应用前景，尤其是对极端温度和高盐环境下维持植物的存活率及产量以及对有效利用耕地资源具有极其重要的理论和现实意义。