一种提取高分子量聚羟基脂肪酸酯的方法及其产品与流程

本发明涉及材料，尤其涉及一种提取高分子量聚羟基脂肪酸酯的方法及其产品。

背景技术：

1、聚羟基脂肪酸酯(pha)是一种具有良好热塑性、可生物降解、生物相容性和可再生性能的聚合物。它作为一种新环保材料和生物医学材料引起了人们的广泛关注。微生物细胞通常产生的聚羟基脂肪酸酯是一种高度结晶的材料，其热性能与聚丙烯(一种从石油中提取的商品塑料)相似。然而，从材料性能上来说，phb比聚丙烯脆，弹性差，在实际生产中不能单独使用，需要加入一定量的改性助剂，但加入改性助剂的这种方式适用范围有限，不能普遍适用，且在实际生产中造粒后的聚羟基脂肪酸酯会随时间推移，分子量会有所下降，导致其应用范围更加受限。已知目前微生物生产的聚羟基脂肪酸酯的分子量大约在0.1×106～1.0×106范围内，且由于聚羟基脂肪酸酯的机械强度随其分子量的增加而增加，高分子量的聚羟基脂肪酸酯，其分子量范围大于1.0×106，因此，生产出高分子量的聚羟基脂肪酸酯具有重要的技术意义。

2、现有工业上大规模使用微生物发酵后提取聚羟基脂肪酸酯的方法为有机溶剂提取法和水相提取法。

3、有机溶剂提取法是利用氯仿、二氯甲烷等良性溶剂，在100～140℃的高温条件下将聚羟基脂肪酸酯溶解，再通过水、乙醇等不良溶剂将聚羟基脂肪酸酯沉淀析出，得到提纯后的聚羟基脂肪酸酯产品，但是这种方法的缺点是：在氯仿中溶解需要升温，对分子量会造成不利影响，且溶剂回收困难。另外，氯仿等溶剂有毒，对生产环境也会产生污染和危害，综合比较来看这种提取成本较高，目前仅适用于实验室规模，不适于大规模的生产。

4、水相提取法的主要方式有物理破壁法、酶解法、化学法等方法。

5、物理提取法是对菌体进行机械破壁。但这个方法能耗较大，且在提取过程中会使用高温、高碱增强破壁效果，但是过长时间的高温高碱处理会严重降低聚羟基脂肪酸酯的分子量；化学法主要是通过使用次氯酸钠、次氯酸盐、sds等化学品进行破壁，但是其也会降低聚羟基脂肪酸酯的分子量，且后期带有化学品的废水处理难度大。

技术实现思路

1、本发明的目的在于：(1)解决现有的水相提取法技术会使分子量损失较大，且分子量分布不均的问题。(2)解决使用有机溶剂提取法提取虽然分子量损失较少，但是使用有机溶剂会增加成本且对环境及操作人员危害较大，且有机溶剂提取法需要在高温的条件下进行，目前仅适用于实验室的小规模提取中，在商业化的大规模上产中增加生产成本，不易操作等问题。

2、具体而言，本发明提供一种提取高分子量聚羟基脂肪酸酯的方法及其产品，该方法是将发酵液通过酶解破壁及离心得到高分子量聚羟基脂肪酸酯。由于高温、高ph值会损失更多的高分子量聚羟基脂肪酸酯，因此，本发明使用酶解法，在低温且中性ph值下对菌体进行温和破壁处理，但由于温度的降低和较温和ph值，会导致部分酶的活力降低，酶解效果减弱，部分蛋白、细胞壁多糖、酯溶蛋白等杂质残留在聚羟基脂肪酸酯表面，这类杂质不易溶于水中，无法通过后续的常规洗涤方式除净，因此在后续引入低级醇类或低级酯类进行二次洗涤，这类有机溶剂安全绿色，且能将上述附着在聚羟基脂肪酸酯表面的杂质溶解，获得纯度、色度等指标达标，且分子量分布均匀的高分子量聚羟基脂肪酸酯产品。

3、更具体地，第一方面，本发明提供一种提取高分子量聚羟基脂肪酸酯的方法，包括：

4、将未破壁的菌体重悬，得料液；

5、所述料液在ph值为7.0～8.0且温度为45℃以内的条件下进行酶解，得酶解液；

6、所述酶解液在不高于4000rpm的离心设备中进行固液分离得沉淀；

7、所述沉淀经低级醇和/或低级酯洗涤。

8、本发明中所提及的聚羟基脂肪酸酯，其根据单体组成可以分为均聚物和共聚物。根据单体的碳原子数，可以是短链聚羟基脂肪酸酯(即，单体为c3-c5的羟基脂肪酸)或者中长链聚羟基脂肪酸酯(即，单体为c6-c18的羟基脂肪酸)，但不限于此。

9、聚羟基脂肪酸酯可以是均聚物，包括但不限于聚羟基丙酸酯(php)、聚羟基丁酸酯(phb)、聚羟基辛酸酯(pho)聚羟基戊酸酯(phv)等，例如，聚-3-羟基丁酸酯(p3hb)、聚-4-羟基丁酸酯(p4hb)、聚-3-羟基丙酸酯(p3hp)或聚-3-羟基戊酸酯(p3hv)等。

10、聚羟基脂肪酸酯可以是共聚物，例如，3-羟基丁酸和4-羟基丁酸的二元共聚物(p34hb)、3-羟基丁酸和3-羟基己酸的二元共聚物(phbhhx)、3-羟基丁酸和3-羟基戊酸的二元共聚物(phbv)、3-羟基辛酸和3-羟基己酸的二元共聚物(p3ho3hhx)、3-羟基丁酸、3-羟基戊酸和3-羟基己酸的三元共聚物(phbvhhx)、3-羟基丁酸共4-羟基丁酸和3-羟基戊酸的三元共聚物(p3hb-co-4hb-co-3hv)等。

11、根据本发明提供的所述提取高分子量聚羟基脂肪酸酯的方法，包括：

12、所述低级醇包括乙醇、丁醇和异戊醇中的一种以上；

13、和/或，所述低级酯包括乙酸甲酯、乙酸乙酯和异戊酸乙酯中的一种以上。

14、本发明中的低级醇和低级酯不限于上述所列出的类型，一般而言，能够通过控制温度等参数，使所使用的洗涤溶剂不溶解聚羟基脂肪酸酯，只溶解杂质相的醇和酯，均满足本发明的要求，其中，所述杂质相包括残留的细胞壁多糖、酯溶蛋白、糖酯等。

15、根据本发明提供的所述提取高分子量聚羟基脂肪酸酯的方法，包括：

16、所述酶解采用复合酶制剂，所述复合酶制剂包括溶菌酶、核酸降解酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、蜗牛酶和蛋白酶；

17、优选地，按质量份数计，所述复合酶制剂包括：3～5份溶菌酶、0.5～1.5核酸降解酶、1～3份葡聚糖酶、2～4份甘露聚糖酶、0.5～1.5份蜗牛酶和1～3份蛋白酶。

18、根据本发明提供的所述提取高分子量聚羟基脂肪酸酯的方法，包括：

19、向所述料液中加入质量百分比大于等于0.01％的所述复合酶制剂进行酶解，酶解时间为10～200min；优选60～120min；

20、优选地，所述酶解温度为40～45℃，更优选为40℃。

21、本发明中所述在ph值为7.0～8.0且温度为45℃以内的条件下进行酶解是指酶解开始到酶解结束，酶解液的ph值和温度始终维持在该条件。在酶解过程中，维持低速搅拌。

22、根据本发明提供的所述提取高分子量聚羟基脂肪酸酯的方法，包括：

23、所述酶解液在3000～3500rpm的离心设备中进行固液分离得沉淀；

24、优选地，所述离心设备为立式离心机、碟片离心机或者卧式螺旋离心机。

25、根据本发明提供的所述提取高分子量聚羟基脂肪酸酯的方法，包括：

26、将发酵液进行固液分离得所述未破壁的菌体；

27、优选地，发酵液进行固液分离是在7000～9000rpm的离心设备中进行；离心时间5～16min。此时，离心设备可以为立式离心机、碟片离心机或者卧式螺旋离心机。

28、本发明中的发酵液作为聚羟基脂肪酸酯的生产原料，可以采用嗜盐菌发酵液，其中嗜盐菌包括嗜盐细菌和/或所述嗜盐古菌，优选地，所述嗜盐菌为嗜盐细菌，进一步优选为盐单胞菌属(halomonas)的细菌及它们衍生菌株或其组合，更优选为单胞菌属下的任意种，例如halomonas bluephagenesis、halomonas campaniensis、halomonasaydingkolgenesis、halomonas aerodenitrificans、halomonas halocynthiae中的任意种。进一步优选为halomonas bluephagenesis td01，保藏登记号为cgmccno.4353，从清华大学获得。

29、根据本发明提供的所述提取高分子量聚羟基脂肪酸酯的方法，包括：

30、所述沉淀经低级醇和/或低级酯洗涤时的温度控制在30℃内；

31、优选地，经水洗后进行低级醇和/或低级酯洗涤。

32、所述沉淀进行低级醇和/或低级酯洗涤时，可以采用离心设备进行离心，离心转速控制在4000rpm以内。所述沉淀进行水洗时也可以采用离心设备进行离心，离心转速控制在4000rpm以内。

33、根据本发明提供的所述提取高分子量聚羟基脂肪酸酯的方法，包括：

34、所述沉淀经低级醇和/或低级酯洗涤后进行干燥，干燥的温度不高于40℃。

35、根据本发明提供的所述提取高分子量聚羟基脂肪酸酯的方法，包括：

36、所述酶解液在不高于4000rpm的离心设备中离心2～10min，优选8min进行固液分离，得悬浊液状态的轻相，所述轻相在7000～12000rpm，优选为8000rpm的离心设备中离心、洗涤、干燥；

37、优选地，所述轻相进行洗涤时包括：经低级醇和/或低级酯洗涤；

38、进一步优选地，所述轻相进行洗涤时包括：经水洗后进行低级醇和/或低级酯洗涤。

39、所述酶解液进行固液分离得到的沉淀和所述轻相，为了收集所述轻相中的聚羟基脂肪酸酯，所述轻相进行洗涤时，其低级醇和/或低级酯洗涤可以采用离心设备进行离心，离心转速控制在8000rpm以内。所述轻相进行水洗时也可以采用离心设备进行离心，离心转速控制在8000rpm以内。所述轻相在干燥的温度也不高于40℃。

40、具体而言，本发明的提取高分子量聚羟基脂肪酸酯的方法包括：

41、(1)使用离心机在7000～9000rpm的转速下将发酵液进行固液分离，离心5～15min。收集菌体，使用水将菌体重悬至原有体积的一半；

42、所选离心机为立式离心机、碟片离心机或者卧式螺旋离心机；

43、(2)将步骤(1)中的获得的料液进行升温至40～45℃，优选40℃，调节ph值至7.0～8.0，优选ph值为7.5；

44、(3)向升温后的料液加入大于等于0.01％(质量百分比)复合酶制剂，开启低速搅拌，维持酶解的时间为10～200min，优选60～120min，酶解过程中维持ph值为7.0～8.0且温度维持40～45℃；

45、按质量份数计，所述复合酶制剂包括：四份溶菌酶、一份核酸降解酶、两份葡聚糖酶、三份甘露聚糖酶、一份蜗牛酶和两份蛋白酶；

46、(4)酶解结束后，使用离心机将酶解液进行固液分离，转速不高于4000rpm，优选3000～3500rpm，离心后分别收集沉淀和轻相，轻相为悬浊液；

47、所选离心机为立式离心机、碟片离心机或者卧式螺旋离心机；

48、(5)将步骤(4)收集的沉淀使用水洗涤1～3次，以充分去除酶解液中的细胞碎片及杂质，最后一次离心后收集沉淀；

49、所述水洗涤过程中，离心转速不高于4000rpm；

50、(6)将步骤(5)收集的沉淀，使用低级醇和/或低级酯进行洗涤，而后使用低级醇和/或低级酯重悬，常温、低速搅拌保持0.5～1h，然后进行离心，离心中转速保持低速离心，转速不高于4000rpm；

51、低级醇和/或低级酯不具有毒性，在实际生产中较为安全，且低温下这些低级醇和/或低级酯作为溶剂，不会溶解聚羟基脂肪酸酯，只会溶解不溶于水的杂质，如残留的细胞壁多糖、酯溶蛋白、糖酯等。

52、(7)收集步骤(6)的沉淀，将其在不高于40℃的温度进行干燥，得第一部分的高分子量聚羟基脂肪酸酯；

53、所述干燥采用冷冻干燥机或双锥干燥机；

54、(8)将步骤(4)中的轻相，在不高于8000rpm的转速下进行离心，收集沉淀，将沉淀重复第(5)、(6)步的水洗、低级醇和/或低级酯洗涤后，使用干燥设备干燥，得剩余部分的高分子量聚羟基脂肪酸酯。

55、对于不同酶解液，因酶解程度、细胞裂解程度或者初始分子量的不同，在相同转速下，所得到的沉淀的分子量存在不同，对于酶解程度相近的酶解液，固液分离时的转速对分子量损失影响非常显著。对于初始分子量为145w～190w的酶解液，在经本发明特定酶解和特定固液分离的方法处理时，步骤(7)得到的聚羟基脂肪酸酯的分子量大于步骤(8)得到的聚羟基脂肪酸酯分子量，且步骤(7)的聚羟基脂肪酸酯的收率达到75％，两步所得到的分子量均为高分子量聚羟基脂肪酸酯，总收率达到93％以上，纯度达到99％以上，符合本发明后续应用需求，该方法不仅避免使用不环保的有机溶剂，也使得本发明高分子量聚羟基脂肪酸酯的分子量分布更加均匀。

56、第二方面，本发明还提供如上所述方法得到的产品。

57、本发明的高分子量聚羟基脂肪酸酯，在诸多领域存在高价值的应用，比如：替代传统的石油基塑料制造可降解的塑料制品，如包装材料、农膜、袋子、容器、土壤修复材料等；生物医学材料，如可降解的缝合线、缓释药物输送系统、植入材料和生物可降解的医疗器械等；纺织品，如服装和家居用品等。

58、本发明提供的一种提取高分子量聚羟基脂肪酸酯的方法及其产品，通过使用常温下酶解加低速离心法得到的聚羟基脂肪酸酯的分子量和发酵液相比，降解量＜10％，通过这种方法加上精提步骤的有机洗涤可以获得的聚羟基脂肪酸酯的纯度高达99.0％以上。将酶解后的聚羟基脂肪酸酯粗品使用离心机进行离心分离洗涤时，选择低速离心，所得上清液可以通过合并后得到较沉淀中聚羟基脂肪酸酯低而仍然属于高分子量的聚羟基脂肪酸酯，使总收率达93％以上。而且，低速离心可以区分较低分子量的聚羟基脂肪酸酯，获得分子量更高及分子量分布更均匀的产品。本发明提供了一个简单方便的提取高分子量聚羟基脂肪酸酯的方法，使用此种方式提取到的聚羟基脂肪酸酯分子量损失少且总收率高，且操作简便，提取步骤成本较低，便于在工业生产上放大，在聚羟基脂肪酸酯应用领域上具有很大的发展前景。