一种稳定同位素标记赛庚啶内标试剂的制备方法与流程

本发明涉及一种食品安全检测用稳定同位素标记赛庚啶内标试剂的制备方法，属于食品安全检测用标准物质研发领域。

背景技术：

1、赛庚啶（cyproheptadine）是一种抗5-羟色胺、抗组胺的药物，是一种临床上常用于人体的抗过敏药物。因其具有α-受体阻断活性和中枢镇静作用，可阻断下丘脑5-羟色胺活性，兴奋摄食中枢进而引起饥饿感，减少糖的消耗利用，使食量和体质量增加，具有增进食欲的作用，因而一些不法分子将其掺入动物饲料中，以达到增加动物体质量的目的。2010年，上海市兽药饲料检测所首次发现赛庚啶被一些不法畜牧养殖企业作为新型养殖促进剂非法使用，但食用含有赛庚啶残留的动物源性食品，会对人体健康产生一定的危害性，对儿童的作用尤为明显，高浓度可直接引发昏迷、呼吸急促、全身无力等中毒症状。为防止赛庚啶在饲料等生产性原料中的应用，加强饲料生产、养殖等行业的质量安全监管，保证饲料和动物源性产品的质量安全， 2010 年 12 月 27 日发布了第 1519 号公告 《禁止在饲料和动物饮水中使用的物质》，明确禁止将赛庚啶作为家畜的生产促进剂。

2、目前，我国检测该物质的相关标准有1486号公告-2-2010 《饲料中可乐定和赛庚啶的测定 液相色谱-串联质谱法》、第197号-8-2019 《动物毛发中赛庚啶残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》、《sn/t 5148-2019 出口动物源食品中可乐定和赛庚啶残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法》、《gb 31660.7-2019 食品安全国家标准 猪组织和尿液中赛庚啶及可乐定残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》等。

3、目前只有《gb 31660.7-2019 食品安全国家标准 猪组织和尿液中赛庚啶及可乐定残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》检测标准中采用内标法来进行定量检测，但因国内无相对应的赛庚啶稳定同位素标记内标化合物供应，而国外产品进口价格昂贵、供货周期长且供应不稳定，所以该标准中的可定乐的内标采用了盐酸可定乐-d4，但是赛庚啶的内标只采用了盐酸二苯拉林作为替代品来使用。众所周知，稳定同位素稀释质谱法是国际上公认的痕量检测的“金标准”，能够显著的降低基质效应，提高检测结果的精确度，并且使用该化合物对应的稳定同位素标记的化合物作为内标来使用经行内标法检测定量会显著提高检测方法的灵敏度和结果的准确性。因此，研制稳定同位素标记赛庚啶内标试剂对于我国食品安全监督检测工作相关领域具有重要意义。

4、目前，现有技术中该天然丰度的化合物合成文献有很多，例如路线一：cid, m.m.; seijas, j. a.等于1988年发表的new synthesis of cyproheptadine and relatedcompounds using low valent titanium[j]. tetrahedron，1988，44（19）：6197-6200。该文献是用二苯并环庚三烯-5-酮和n-乙氧羰基-4-哌啶酮在低价肽和还原剂金属锂的作用生成中间体后，再用氢化铝锂还原得到赛庚啶。

5、路线二：公开的国际专利（wo 2010100990）“process for the production ofnucleophilic adducts by grignardreaction, and nucleophilic addition reactant”中是用n-甲基-4-氯哌啶和镁屑生成格式试剂后和二苯并环庚三烯-5-酮经格式反应后，再进行消去反应得到赛庚啶。

6、路线三：授权中国发明专利“一种赛庚啶的合成方法”（cn 112552230 b）中是将二苯并环庚三烯-5-酮和n-甲基哌啶-4-酮溶于溶剂中，加入低价钛和还原剂，在加热的情况下合成赛庚啶粗品，然后加入盐酸使其形成赛庚啶。

7、上述路线一中采用的三氯化钛和金属锂混合物为强还原剂。易自燃，暴露在空气或潮气中能燃烧。受高热分解产生有毒的腐蚀性烟气，且第二步还原为n-甲基时需要使用2.5当量的氢化铝锂，不符合同位素标记化合物合成中原子经济性的原则，且容易造成同位素丰度的稀释；路线二中在合成路线中涉及格式试剂的制备，无水无氧条件要求严格，且格式试剂的用量为1.5当量，不符合同位素标记化合物合成中原子经济性的原则；路线三中所使用的三氯化钛同上述缺点，四氯化钛具有强烈的腐蚀性和刺激性，此三条路线均不适合用来合成稳定同位素标记赛庚啶内标试剂。

8、截至目前，稳定同位素标记的赛庚啶内标试剂的合成路线及工艺均无文献报道。

9、因此，亟需开发一种原料易得、操作安全简单、避免使用有毒刺激性原料、反应条件温和、反应路线短、最终产品总收率高且易分离提纯、同位素丰度不稀释的稳定同位素标记赛庚啶内标试剂的制备方法，以满足该化合物在国内食品安全监督监管方面日益增长的应用需求。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种适用于食品安全检测用稳定同位素标记赛庚啶内标试剂的制备路线方法。该制备路线方法原料易得、操作简单、避免使用有毒刺激性原料、反应条件温和、反应路线短、最终产品总收率高且易分离提纯、化学纯度高，同位素丰度不稀释。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：1. 一种稳定同位素标记赛庚啶内标试剂的制备方法，该稳定同位素标记赛庚啶内标试剂的化学结构如式（稳定同位素标记赛庚啶）所示：

3、

4、（稳定同位素标记赛庚啶）

5、其中x为12c或13c，y为h或d，其特征在于，其制备路线为：

6、

7、其中，x为12c或13c，y为h或d，r为cl、br或i，制备步骤如下：

8、（1）在有机溶剂、碱、相转移催化剂存在条件下，加入4-卤代哌啶（i），然后加入稳定同位素标记对甲苯磺酸甲酯（ii），在30℃～120℃条件下，反应8～24小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，反应混合溶液用水淬灭，过滤，滤液用有机溶剂萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，加入干燥剂干燥，减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到稳定同位素标记n-甲基-4-卤代哌啶（iii）；

9、该步骤反应如下所示：

10、

11、其中，x为12c或13c，y为h或d，r为cl、br或i；

12、（2）将步骤（1）所得的稳定同位素标记n-甲基-4-卤代哌啶（iii）和三苯基膦混合在一起，在80℃～150℃条件下，反应12～48小时；得到的稳定同位素中间体标记膦盐（iv）加溶剂过滤后直接进行下一步反应；

13、该步骤反应如下所示：

14、

15、其中，x为12c或13c，y为h或d，r为cl、br或i；

16、（3）将步骤（2）所得的稳定同位素标记的膦盐（iv）和二苯并环庚三烯-5-酮在有机溶剂和碱的存在下，在0℃～120℃条件下，反应2～24小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，反应液过滤，滤液减压蒸馏除去溶剂；加入酸调节ph值，用有机溶剂萃取，合并有机相，依次用水洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，加入干燥剂干燥；减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到纯品得到稳定同位素标记赛庚啶。

17、该步骤反应如下所示：

18、

19、其中，x为12c或13c，y为h或d，r为cl、br或i；

20、所述步骤（1）中有机溶剂为四氢呋喃、二氧六环、甲苯、二甲苯、2-甲基四氢呋喃、n，n-二甲基甲酰胺、n，n-二甲基乙酰胺、甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈中的任意一种或几种；碱为碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠、氢氧化钾、氢化钠、氢化钾、叔丁醇钠、叔丁醇钾及其水溶液中的任意一种或几种；相转移催化剂为四丁基氯化铵、四丁基溴化铵、苄基三乙基氯化铵、三辛基甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基氯化铵、18冠6、聚乙二醇中的任意一种或几种；稳定同位素标记的对甲苯磺酸甲酯为氘标记、13c标记或13c和氘双标记的对甲苯磺酸甲酯中的任意一种；n-甲基-4-卤代哌啶为n-甲基-4-氯哌啶、n-甲基-4-溴哌啶、或n-甲基-4-碘哌啶中的任意一种；反应温度为30℃～120℃；反应时间为12～48小时。

21、优选地，所述步骤（1）中的有机溶剂为n，n-二甲基甲酰胺、四氢呋喃或乙腈；

22、优选地，所述步骤（1）中的碱为碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钠、叔丁醇钠及其水溶液中的一种；所述化合物（ii）与碱的摩尔比为（1：1）~（1：3）；

23、优选地，所述步骤（1）中的相转移催化剂为四丁基溴化铵、苄基三乙基氯化铵、三辛基甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵中的一种；所述化合物（ii）与相转移催化剂的摩尔比为（1：2）~（1：10）；

24、优选地，所述化合物（ii）与化合物（i）的摩尔比为（1：1～1：1.5）。

25、优选地，所述步骤（1）中的反应温度为50℃～90℃；反应时间为18～24小时。

26、所述步骤（2）中，化合物（iii）稳定同位素标记的n-甲基-4-卤代哌啶为n-甲基-4-氯哌啶（n-甲基-d3）、n-甲基-4-氯哌啶（n-甲基-13cd3）、n-甲基-4-氯哌啶（n-甲基-13cd3）、n-甲基-4-溴哌啶（n-甲基-d3）、n-甲基-4-溴哌啶（n-甲基-13cd3）、n-甲基-4-溴哌啶（n-甲基-13cd3）、n-甲基-4-碘哌啶（n-甲基-d3）、n-甲基-4-碘哌啶（n-甲基-13cd3）、n-甲基-4-碘哌啶（n-甲基-13cd3）中的一种；反应温度为80℃～150℃；反应时间为12～48小时；所述化合物（iii）与三苯基膦的摩尔比为（1：3.3）~（1：4.5）。

27、优选地，所述步骤（2）中的化合物（iii）稳定同位素标记的n-甲基-4-卤代哌啶为n-甲基-4-氯哌啶（n-甲基-d3）或n-甲基-4-溴哌啶（n-甲基-d3）。

28、优选地，所述步骤（2）中的反应温度为100℃～140℃；反应时间为24～36小时。

29、所述步骤（3）中，有机溶剂四氢呋喃、乙醚、甲苯、n，n-二甲基甲酰胺、n，n-二甲基乙酰胺、甲醇、乙醇、乙腈中的任意一种或几种；碱为氢化钠、氢化钾、正丁基锂、苯基锂、甲醇钠、乙醇钠、 双(三甲基硅)酰胺锂、 双(三甲基硅)酰胺钠、 双(三甲基硅)酰胺钾中的任意一种或几种；反应温度为-78℃～50℃；反应时间为1～8小时；所述化合物（iii）与无机碱的摩尔比为（1：2）~（1：5）。

30、优选地，所述步骤（3）中的有机溶剂为四氢呋喃、乙醚、甲苯中的一种；

31、优选地，所述步骤（3）中的碱为正丁基锂、氢化钠、氢化钾中的一种；

32、优选地，所述步骤（3）中反应温度为-20℃～30℃；反应时间为4～6小时。

33、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明的食品安全检测用稳定同位素标记赛庚啶内标试剂的制备方法，采用市售可得的中间体及稳定同位素标记对甲苯磺酸甲酯原料，经过n-甲基化、与三苯基膦成膦盐、然后经wittig反应直接得到稳定同位素标记赛庚啶。本发明方法所使用的原料简单易得且价格低廉、避免使用有毒刺激性原料、合成步骤短、反应条件温和、反应收率高；同时具有最终产品副产物少、易于分离提纯、化学纯度高、同位素丰度不稀释等优点。该稳定同位素标记赛庚啶内标试剂的制备路线及方法未有文献报道，该方法制备所得的稳定同位素标记赛庚啶内标试剂化学纯度大于98%，同位素丰度大于99%。本制备方法所制得的食品安全检测用稳定同位素标记赛庚啶内标试剂对我国相关的食品安全监督检测领域的发展具有重要意义。