一种提高褐藻胶裂解酶热稳定性的方法及其应用

本发明涉及一种提高褐藻胶裂解酶热稳定性的方法及其应用，属于基因工程和酶工程。

背景技术：

1、褐藻胶主要是从褐藻类植物的细胞壁及细胞间质中提取出来的具有一定粘性的线性多糖，由两个同分异构单体β-d-甘露糖醛酸(m)和α-l-古洛糖醛酸(g)通过α,β-(1,4)-糖苷键随机排列形成，主要产物种类有均聚甘露糖醛酸(poly-m)、均聚古洛糖醛酸(poly-g)以及m和g随机组合的杂聚物(poly-mg、poly-gm)。褐藻胶低聚糖为褐藻胶水解后形成的聚合度为2-25的低聚物，与褐藻胶相比褐藻胶低聚糖平均分子量小、粘度低、水溶性好，克服了褐藻胶应用时的诸多不足。有研究表明褐藻胶低聚糖是一种益生元，具备多种生理活性，如抗氧化、抗菌、免疫调节以及促进植物生长等活性功能，在医药、食品、农业等领域具有极大的应用潜力。褐藻胶低聚糖是一种海洋来源的功能性低聚糖，是目前的研究热点，值得深入研究和开发。

2、目前褐藻胶的降解方法有3种，分别为物理降解法、化学降解法和生物降解法。在这些方法中，物理法通常操作简单，环境污染小，反应速度快，但无法将褐藻胶完全降解，原料利用率低，同时存在能耗大等不足；化学法一般成本较低，但反应步骤复杂，耗时久，存在多方面缺陷，包括：所用试剂可能腐蚀设备，污染环境，产物存在安全性隐患，以及产物为饱和的褐藻胶低聚糖，褐藻胶低聚糖的活性受到一定破坏等；而生物法集催化效率高，底物专一性强，反应条件温和，产物得率高，节能环保等优点于一体。因此，利用生物酶法降解褐藻胶成为目前的研究热点。

3、然而，天然的褐藻胶裂解酶通常存在产量少、活性低、稳定性差以及酶制剂价格昂贵等不足，限制了褐藻胶低聚糖的制备和应用，使得大部分研究仍停留在实验室阶段，难以满足工业化生产。通过基因工程技术和酶工程技术提高褐藻胶裂解酶的相关性质，不仅可以解决褐藻胶裂解酶稳定性差的问题，还可以增加褐藻胶裂解酶的催化活性，对褐藻胶裂解酶的工业化应用具有重大意义。

4、现有技术当中，有通过基因工程技术提高褐藻胶裂解酶的热稳定性：

5、例如，zhou，meng和zhang等人通过综合策略包括序列分析，结构分析及计算机辅助δδg数值计算对来源于pseudomonas mendocina的褐藻胶裂解酶pmd进行定点突变，得到5个单点突变体a74i，a74v，g75v，a240v和d250g，它们的tm值与野生型相比分别提高了3.15℃，3.94℃，5.21℃，2.56℃和4.8℃，然后按照δtm大小进行组合得到tm值进一步提高的突变体m2(g75v-d250g)，m3(g75v-d250g-a74v)，m4(g75v-d250g-a74v-a240v)，tm分别提高了6.88℃，8.07℃和9.34℃。(licheng zhou,meng q,zhang r,et al.improvingthermostability of a pl5 family alginate lyase with combination of rationaldesign strategies[j].international journal of biological macromolecules,2023.)；zhang，li和pan等人对来源于flavobacterium sp.umi-01的褐藻胶裂解酶flalya利用计算机辅助计算b因子和自由能变化构建突变体，得到了tm提高0.35℃的突变体h71d和tm提高1.26℃的突变体h176k，并且突变体h176k在50℃时半衰期几乎为野生型的两倍。(zhang x,li w,pan l,et al.improving the thermostability of alginate lyaseflalya with high expression by computer-aided rational design for industrialpreparation of alginate oligosaccharides[j].frontiers in bioengineering andbiotechnology,2022,10.)；yang，liu和li等人通过合理设计将二硫键引入来自microbulbifersp.q7的褐藻胶裂解酶calym，以提高其热稳定性，最终得到突变体d102c-a300c的tm提高了1.7℃，突变体g103c-t113c的tm提高了0.4℃，并且突变体d102c-a300c在55℃的半衰期约为calym的1.9倍，催化效率约为calym的1.494倍。(yang m,yang s,liu z,et al.rational design of alginate lyase from microbulbifer sp.q7 to improvethermal stability[j].marine drugs,2019,17(6):378.)。

6、但目前工业化生产大多在高温条件下进行，现有的褐藻胶裂解酶还无法在高温环境下长时间保持较好的活性和稳定性，无法满足工业化生产条件。因此，开发高耐热性的褐藻胶裂解酶将显著提升褐藻胶裂解酶的工业应用价值，有助于降低工业化生产褐藻胶低聚糖的成本，推广酶法制备褐藻胶低聚糖，实现海洋资源的高值化利用。

技术实现思路

1、[技术问题]

2、褐藻胶在室温下溶解度低，高浓度的褐藻胶溶液室温下溶液粘度高，不利于酶解反应的进行。在高温下能增强褐藻胶的溶解度并降低褐藻胶溶液的黏度，有利于褐藻胶裂解酶与底物充分接触反应，提高催化效率。然而，现有的褐藻胶裂解酶热稳定性较差，并不能够满足工业化生产褐藻胶低聚糖时间长、温度高的要求，使得褐藻胶裂解酶实际工业应用受到较大限制。

3、[技术方案]

4、发明人前期通过对已经解析晶体结构的不同来源、水解褐藻胶得到不同产物的褐藻胶裂解酶进行文献调研，发现来源于psychromonas sp.c-3的内切型褐藻胶裂解酶alyc3(ncbi登录号：qop59290)，已解析晶体结构(pdb：7c8g)，主要产物为甘露糖醛酸三糖。

5、本发明经对来源于psychromonas sp.c-3的野生型褐藻胶裂解酶alyc3及本发明的突变体表征后，发现单一点突变体极大的提高了褐藻胶裂解酶的耐热性，其表观熔融温度(tm)最多提高了11.24℃，经过单点组合后得到组合突变体，其表观熔融温度(tm)最多提高了17.05℃，与目前已报导提高褐藻胶裂解酶热力学热稳定性文章相比，提高显著，所有突变体最适温度提高了10℃，单一点突变体t1/2最多提高1.66倍，经过单点组合后得到组合突变体t1/2最多提高8.21倍，同时全部突变体的酶活没有明显损失，部突变体酶活分略有提高，这些特性有助于提高工业化生产中褐藻胶原料的利用率，提高褐藻胶低聚糖的生产效率，降低生产成本，增加褐藻胶低聚糖的产量，赋予褐藻胶裂解酶更大的工业化应用价值，有助于海洋资源的开发利用。

6、本发明通过如下的技术方案实现上述目的：

7、本发明提供了热稳定性提高的褐藻胶裂解酶突变体，以及能够表达所述褐藻胶裂解酶突变体的大肠杆菌工程菌。

8、本发明提供了一种褐藻胶裂解酶突变体，所述突变体是对seq id no.4所示的褐藻胶裂解酶的第18位、第34位、第73位、第94位、第132位、第137位、第138位、第153位、第161位或第256位中的至少一处氨基酸进行突变得到的。

9、所述褐藻胶裂解酶为氨基酸序列如seq id no.4所示的褐藻胶裂解酶；或与seqid no.4所示的氨基酸序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列同一性的褐藻胶裂解酶；或与seq id no.2所示的编码序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％序列的褐藻胶裂解酶基因。

10、在本发明的一种实施方式中，所述突变包括取代、缺失或添加。

11、在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.4所示的第18位的苏氨酸突变为脯氨酸；命名为：t18p。

12、在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.4所示的第34位的丙氨酸突变为脯氨酸；命名为：a34p。

13、在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.4所示的第73位的天冬酰胺突变为甘氨酸；命名为：n73g。

14、在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.4所示的第94位的亮氨酸酸突变为苯丙氨酸；命名为：l94f。

15、在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.4所示的第132位的天冬酰胺突变为天冬氨酸；命名为：n132d。

16、在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.4所示的第137位的天冬酰胺突变为酪氨酸；命名为：n137y。

17、在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.4所示的第138位的缬氨酸突变为异亮氨酸；命名为：v138i。

18、在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.4所示的第153位的丝氨酸突变为甘氨酸；命名为：s153g。

19、在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.4所示的第161位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸；命名为：m161i。

20、在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.4所示的第256位的天冬酰胺突变为酪氨酸；命名为：n256y。

21、在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.4所示的第34位的丙氨酸突变为脯氨酸、第73位的天冬酰胺突变为甘氨酸；命名为：a34p-n73g。

22、在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.4所示的第34位的丙氨酸突变为脯氨酸、第94位的亮氨酸酸突变为苯丙氨酸；命名为：a34p-l94f。

23、在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.4所示的第34位的丙氨酸突变为脯氨酸、第137位的天冬酰胺突变为酪氨酸；命名为：a34p-n137y。

24、在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.4所示的第34位的丙氨酸突变为脯氨酸、第161位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸；命名为：a34p-m161i。

25、在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的第73位的天冬酰胺突变为甘氨酸、第94位的亮氨酸酸突变为苯丙氨酸；命名为：n73g-l94f。

26、在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.4所示的第73位的天冬酰胺突变为甘氨酸、第137位的天冬酰胺突变为酪氨酸；命名为：n73g-n137y。

27、在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.4所示的第73位的天冬酰胺突变为甘氨酸、第161位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸；命名为：n73g-m161i。

28、在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.4所示的第94位的亮氨酸酸突变为苯丙氨酸、第137位的天冬酰胺突变为酪氨酸；命名为：l94f-n137y。

29、在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.4所示的第94位的亮氨酸酸突变为苯丙氨酸、第161位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸；命名为：l94f-m161i。

30、在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.4所示的第137位的天冬酰胺突变为酪氨酸、第161位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸；命名为：n137y-m161i。

31、在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.4所示的第34位的丙氨酸突变为脯氨酸、第94位的亮氨酸酸突变为苯丙氨酸、第161位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸；命名为：a34p-l94f-m161i。

32、在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.4所示的第34位的丙氨酸突变为脯氨酸、第137位的天冬酰胺突变为酪氨酸、第161位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸；命名为：a34p-n137y-m161i。

33、在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.4所示的第34位的丙氨酸突变为脯氨酸、第94位的亮氨酸酸突变为苯丙氨酸、第137位的天冬酰胺突变为酪氨酸、第161位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸；命名为：a34p-l94f-n137y-m161i。

34、本发明提供了编码上述突变体的基因。

35、在本发明的一种实施方式中，编码所述野生型亲本酶褐藻胶裂解酶的核苷酸序列如seq id.3所示。

36、本发明提供了表达上述突变体或上述基因的重组载体。

37、在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pet系列、duet系列、pgex系列、phy300、phy300plk、ppic3k或ppic9k系列载体。

38、在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pet28a(+)。

39、本发明提供了表达上述突变体，或含有上述基因，或含有上述重组载体的重组细胞。

40、在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以原核细胞或真核细胞为表达宿主。

41、在本发明的一种实施方式中，所述原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属；所述真核细胞为真菌细胞。

42、在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以大肠杆菌e.coli bl21(de3)为表达宿主。

43、本发明提供了一种制备上述突变体的方法，所述方法步骤如下：

44、(1)根据确定的突变位点，设计定点突变引物，以携带褐藻胶裂解酶编码基因的载体为模板进行定点突变，构建含有编码突变体基因的载体；

45、(2)将含有编码突变体基因的载体转化至大肠杆菌e.coli bl(21)de3的表达宿主中；

46、(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，离心收集细胞，超声细胞破碎仪破碎细胞后所得上清液即为褐藻胶裂解酶突变体粗酶液；

47、(4)将褐藻胶裂解酶突变体粗酶液过镍柱纯化后得褐藻胶裂解酶突变体纯酶液。

48、本发明还提供了一种提高褐藻胶裂解酶热稳定性的方法，所述方法为，将氨基酸序列如seq id no.4所示的褐藻胶裂解酶的第18位苏氨酸突变为脯氨酸；或将氨基酸序列如seq id no.4所示的褐藻胶裂解酶的第34位丙氨酸突变为脯氨酸；或将氨基酸序列如seqid no.4所示的褐藻胶裂解酶的第73位天冬酰胺突变为甘氨酸；或将氨基酸序列如seq idno.4所示的褐藻胶裂解酶的第94位亮氨酸酸突变为苯丙氨酸；或将氨基酸序列如seq idno.4所示的褐藻胶裂解酶的第132位天冬酰胺突变为天冬氨酸；或将氨基酸序列如seq idno.4所示的褐藻胶裂解酶的第137位天冬酰胺突变为酪氨酸；或将氨基酸序列如seq idno.4所示的褐藻胶裂解酶的第138位缬氨酸突变为异亮氨酸；或将氨基酸序列如seq idno.4所示的褐藻胶裂解酶的第153位丝氨酸突变为甘氨酸；或将氨基酸序列如seq id no.4所示的褐藻胶裂解酶的第161位甲硫氨酸突变为异亮氨酸；或将氨基酸序列如seq id no.4所示的褐藻胶裂解酶的第256位天冬酰胺突变为酪氨酸。

49、本发明提供了含有所述褐藻胶裂解酶突变体的组合物。

50、在本发明的一种实施方式中，所述组合物以所述褐藻胶裂解酶作为主要酶组分，并含有一种或多种佐剂。

51、在本发明的一种实施方式中，所述佐剂包括但不限于酶稳定剂。

52、在本发明的一种实施方式中，所述酶稳定剂包括甘露醇、dtt、海藻糖或维生素c。

53、有益效果：

54、1.本发明公开了热稳定性提高的褐藻胶裂解酶突变体，属于基因工程技术和酶工程领域。采用本发明的方法获得了热稳定性提高的单一或组合突变体，是现有报道中热稳定性提高最多的褐藻胶裂解酶突变体，并且本发明的突变体在热稳定性提高的同时酶活基本没有明显损失，部分部突变体酶活略有提高。单一突变体t18p、a34p、n73g、l94f、n132d、n137y,v138i、s153g、m161i、n256y的表观熔融温度提高了1.01-11.24℃，相对酶活为野生型的96.09％-112.32％，半衰期为野生型的

55、1.01-1.66倍。组合突变体a34p-l94f-n137y-m161i表观熔融温度提高了17.05℃，相对酶活为野生型的123.93％，半衰期为野生型的8.21倍。

56、2.本发明提供的突变体最适反应温度都提高了10℃，达到30℃，且热稳定得到显著提高。其中，单一突变体a34p、n73g、l94f、n137y、m161i在30℃下孵育360min后均能保留90％以上的原始酶活，在相同条件下组合突变体均能保持93％以上的原始酶活，而野生型仅保留56.95％的原始酶活。当在40℃孵育孵育360min后，单一突变体a34p、n73g、l94f、n137y、m161i均能保留40％以上的原始酶活，在相同条件下组合突变体(除a34p-l94f-m161i外)均能保持67％以上的原始酶活，而野生型基本失活。当在45℃孵育孵育180min后，单一突变体a34p、n73g、l94f、n137y、m161i均能保留11％以上的原始酶活，在相同条件下组合突变体(除a34p-l94f-m161i外)均能保持15％以上的原始酶活，而野生型基本失活。

57、3.本发明提供的突变体a34p-l94f-n137y-m161i相较于野生型酶alyc3最适温度提高10℃，相对酶活为野生型的123.93％，并表现出良好的耐热性和活性，在45℃孵育360min后仍能保留79.69％的原始酶活，而野生型在相同条件下孵育180min后基本丧失活性。突变体a34p-l94f-n137y-m161i能在高温下降解褐藻胶，如在40℃下，降解褐藻胶180min后褐藻胶三糖产量为1.1226mg/ml，而野生型酶在相同条件下褐藻胶三糖产量为0.1229mg/ml，表明突变体具有良好的热稳定性，提高了褐藻胶的水解效率，具有良好的工业应用前景。