敲除oxdC基因的产杆菌肽工程菌及其制备方法和应用与流程

本发明涉及基因工程和发酵工程领域，尤其涉及敲除 oxdc基因的产杆菌肽工程菌及其制备方法和应用。

背景技术：

1、地衣芽胞杆菌是国际公认的具有生物安全性（gras）的工业微生物菌株，其具有遗传背景清晰、鲁棒性强、性状稳定等优点，因而被广泛应用于发酵生产聚γ-谷氨酸、地衣素、苯乙醇、杆菌肽等生物化工产品。

2、杆菌肽是一种由枯草芽胞杆菌和地衣芽胞杆菌合成的多肽类抗生素，其可以强烈抑制革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌的生长，并与其它抗生素组合使用具有协同增强效果，因而被广泛应用于饲料添加和兽药行业。杆菌肽的结构包括鸟氨酸（orn）、d-苯丙氨酸（d-phe）、组氨酸（his）、d-天冬氨酸（d-asp）、天冬酰胺（asn）、赖氨酸（lys）、d-谷氨酸（d-glu）、半胱氨酸（cys）、亮氨酸（leu）、异亮氨酸（ile）和缬氨酸（val）11种氨基酸。

3、近年来，关于杆菌肽高产的策略主要集中在增强杆菌肽前体氨基酸的供给水平上；也有通过改造转录调控因子（例如phop、kipr、lrps）来提高杆菌肽产量的报道，但是，phop、kipr、lrps转录因子在细菌中的作用机理尚不明确，并且，也未见这些转录因子与oxdc（包括oxdc蛋白、oxdc的编码基因及oxdc的调控对象）之间关联性的任何相关报道。并且，次级代谢产物的合成通常受到细胞全局代谢的多层次影响，因此，对于众多间接影响杆菌肽产量的限制因素有待进一步挖掘。

4、草酸脱羧酶（oxalate decarboxylase，oxdc）属cupin蛋白超家族，是一种包含mn2+的均一聚合酶，能够在没有辅因子的条件下催化草酸转化为甲酸和co2，目前关于草酸脱羧反应与杆菌肽产量之间的关系未见任何报道，也无法推断出草酸脱羧酶的表达水平与杆菌肽合成之间的关系。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供敲除 oxdc基因的产杆菌肽工程菌的制备方法，其制备的产杆菌肽工程菌发酵生产杆菌肽的能力更强、产率更高。

2、敲除 oxdc基因的产杆菌肽工程菌的制备方法，其是采用基因工程手段敲除地衣芽孢杆菌的基因组中的 oxdc基因，获得敲除了 oxdc基因后的重组菌株（即所述产杆菌肽工程菌），所述 oxdc基因的核苷酸序列为seq id no.1中所示。

3、草酸脱羧酶oxdc的作用是：催化草酸转化为甲酸和co2。同时，草酸具有抑制微生物生长的作用。因此，一般会认为：敲除了草酸脱羧酶oxdc的编码基因 oxdc，会影响草酸的转化导致草酸增多而不利于菌株的生长，进而影响菌株发酵生产杆菌肽，即敲除 oxdc基因理论上不利于杆菌肽产率的提高。而本发明首次通过基因工程的方法在地衣芽孢杆菌的基因组内成功敲除草酸脱羧酶oxdc的编码基因— oxdc基因，却意外发现：敲除草酸脱羧酶oxdc的编码基因后得到的重组菌株，与原始菌株相比，具有更强的杆菌肽发酵生产能力，为提高杆菌肽产量提供了一种新策略。

4、优选的，所述地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌dw2（ bacillus licheniformis dw2），其已于2011年10月12日保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno: m2011344，地衣芽胞杆菌dw2为现有的一种高产杆菌肽的菌株，以此作为出发菌株，所得到的重组菌株的杆菌肽产量更高。

5、优选的，所述采用基因工程手段敲除地衣芽孢杆菌的基因组中的 oxdc基因，包括如下步骤：

6、（1）以地衣芽胞杆菌dw2的基因组为模板，通过pcr扩增出 oxdc基因的上游同源臂和下游同源臂；

7、（2）利用重叠延伸pcr将步骤（1）的上游同源臂和下游同源臂连接在一起，得到同源臂融合片段；

8、（3）用限制性内切酶 bamhi和 xbai对步骤（2）中得到的同源臂融合片段进行双酶切，得到酶切融合片段a；同时采用 bamhi和 xbai对质粒t2(2)-ori进行双酶切，得到酶切后线性质粒片段；

9、（4）将步骤（3）得到的酶切融合片段a和线性质粒片段经 t4-dna连接酶进行连接，经过氯化钙转化法将酶连的产物转入大肠杆菌dh5α中，以卡那霉素为抗性筛选标记，并经过菌落pcr，得到阳性转化子，经过测序得到 oxdc基因的敲除质粒t2(2)-ori- oxdc；

10、（5）将步骤（4）中构建的t2(2)-ori- oxdc转入地衣芽胞杆菌dw2中，经卡那青霉素抗性筛选得到阳性转化子；

11、（6）将步骤（5）中菌落pcr验证正确的阳性转化子经过数次转接培养，并进行菌落pcr检测，筛选得到 oxdc基因的上游臂或 oxdc基因的下游臂与地衣芽胞杆菌dw2基因组dna产生单交换的阳性单交换结合子菌株；

12、（7）将步骤（6）中得到的阳性单交换结合子菌株经过数次转接培养，结合pcr法筛选得到敲除了 oxdc基因后的重组菌株，即所述产杆菌肽工程菌，并命名为：dw2△ oxdc。

13、本发明的目的之二在于提供一种敲除 oxdc基因的产杆菌肽工程菌，其为采用本发明的目的之一的所述敲除 oxdc基因的产杆菌肽工程菌的制备方法构建得到的重组菌株。

14、本发明的目的之三在于提供本发明的目的之二所述的产杆菌肽工程菌在杆菌肽生产中的应用，包括种子培养和发酵培养。

15、以上所述应用中，所述发酵培养所使用的发酵培养基配方为60-100 g/l豆粕；30-50 g/l玉米淀粉；4-8 g/l 碳酸钙和0.5-2 g/l 硫酸铵。

16、与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：

17、本发明突破常规，首次通过在地衣芽胞杆菌中敲除 oxdc基因来提高杆菌肽产量，为杆菌肽高产提供了一种新策略。与地衣芽胞杆菌dw2相比，通过本发明构建得到的地衣芽胞杆菌重组菌株dw2△ oxdc的杆菌肽产量提高了16%以上。本发明的研究结果表明：通过敲除 oxdc基因来提高杆菌肽产量是一个十分有效且可行的方法。