番茄TBR5基因、抗性相关SNP位点及应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及与番茄褐色皱纹果病毒抗性相关tbr5基因、snp位点及应用。

背景技术：

1、番茄褐色皱果病毒侵染的植物主要包括茄科(solanaceae family)植物，如马铃薯、番茄和辣椒，并且该病毒是世界上对茄科作物生长威胁最严重的病毒之一。番茄褐色皱果病毒在设施栽培的番茄生产中危害尤为突出，并且该病毒可以通过种子传播，在栽培中还可以通过手、衣服、工具在植物间传播，这使得病毒的侵染性大大增加。2021年4月，番茄褐色皱果病毒(tobrfv)被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。

2、该病毒2014年12月首次在约旦和以色列的温室中被鉴定出来，种植的番茄上有轻微花叶、叶片畸形的病症，而且在果实上出现严重着色不均、产生褐色皱纹等症状，严重影响番茄的商品性。经检测该病毒粒子呈杆状，与典型的烟草花叶病毒属病毒粒子形态特征类似。采用rt-pcr检测番茄上常见的病毒，利用烟草花叶病毒属的通用引物扩增出约400bp片段，测序后发现其与番茄轻斑驳病毒(tomato mild mottle virus，tommv)同源性最高，核苷酸同源性为86％；进一步采用rt-pcr及5’-和3’-race技术，获得新病毒的基因组全长，基因组结构是典型烟草花叶病毒属病毒结构；根据其侵染番茄症状、基因组特征，将该病毒命名为番茄褐色皱纹病毒tobrfv(salem et al.2015)。

3、目前番茄花叶病毒(tomv)有4种毒株(tm-0、tm-1、tm-2和tm-22)和3个来源于野生种的抗性基因(r)tm1、tm2和tm22。tm1基因来自多毛番茄(solanum habrochaites)，是不完全显性的。tm2和tm22基因来自秘鲁番茄(solanum peruvianum)，对tomv有显性完全抗性。但是，这些抗病基因对tobrfv没有抗性，说明这是新的番茄花叶病毒毒株。在墨西哥、约旦和以色列报道的毒株均可以突破番茄花叶病毒tm22基因的抗性。亟需鉴定新的抗病基因，用于新的抗病品种选育。

4、我国是番茄、辣椒生产大国，该病毒一旦传入，将严重影响我国番茄、辣椒生产及相关产业发展，造成不可估量的损失。由于这种新的tobrfv传播很快并已经对某些地区的番茄生产造成了重大影响，因此获得该病毒抗性番茄植物的紧迫性非常高。在本发明中组织了抗病鉴定和种质筛选，为抗病品种的选育奠定基础。

5、关于与番茄褐色皱纹果病毒抗性相关的基因，本发明的发明人在前期的工作中已经找到了一些相关基因及其位点，在公开号为cn116732220a的发明专利中已经公开，随着研究的深入，又找到了一个新的和番茄褐色皱纹果病毒抗性相关的基因，该基因位于5号染色体上，命名为tbr5。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供与番茄褐色皱纹果病毒抗性相关的tbr5基因以及相关snp位点。

2、本发明的目的之二在于提供上述tbr5基因、snp位点在番茄褐色皱纹果病毒抗性育种中的应用。

3、为了实现上述目的，本发明的技术方案概述如下：

4、本发明提供了5号染色体上的抗病基因tbr5(solyc05g024300，以下称“tbr5基因”)。

5、本发明通过番茄参考基因组查找的tbr5基因全序列，如seq id no.1所示；本发明原有抗性材料中的自然突变的亲本(如编号21-195、21-200、22-110、22-133)序列，如seqid no.2所示。经过序列比对，该抗性株系的父母本均存在在sl4.0ch05：31182840的位置处碱基由a突变成了t，在sl4.0ch05：31183510的位置处碱基由t突变成了c的突变(如图1所示)。

6、所以本发明公开了与番茄褐色皱纹果病毒抗性相关的snp位点以及在鉴定番茄褐色皱纹果病毒抗性中的应用，所述snp位点位于番茄5号染色体，包括tbr5-1和tbr5-2，tbr5-1在sl4.0上的位置是sl4.0ch05_31182840，该位点的碱基为a/t，tbr5-2在sl4.0上的位置是sl4.0ch05_31183510，该位点的碱基为t/c。当sl4.0ch05_31182840位置的碱基为t，以及sl4.0ch05_31183510位置的碱基为c时，鉴定的材料为对褐色皱纹果病毒的抗性增强的材料。

7、本发明还保护snp位点在与番茄褐色皱纹果病毒抗性相关的tbr5基因定位中的应用，本发明通过检测全部抗性亲本发现与f1代亲本相同类型的纯合突变。同时，由于在sl4.0ch05∶31183510处的碱基突变使得该基因的终止密码子发生改变，进而推测植株的抗性是tbr5基因的功能发挥作用。

8、继而发明人对tbr5基因的功能进行了验证，通过基因编辑技术获得tbr5基因编辑株系，结果发现，通过和野生型相比，所述tbr5基因编辑株系对褐色皱纹果病毒的抗性增强，也就是说对基因tbr5进行编辑后赋予其对tobrfv的抗性。因此，可以采用本发明公开的上述位点对tbr5基因进行定位。

9、本发明还保护一种植物育种方法，所述方法为将tbr5基因通过基因编辑技术获得目的植物，基因通过基因编辑技术获得目的植物，使得目的植物中的褐色皱果病毒抗性高于目的植物。优选地，所述植物为番茄。

10、本发明涉及对番茄褐皱果病毒有抗性的番茄种质资源，本发明涉及所述番茄褐色皱果病毒抗性番茄种质资源的后代、种子和果实，适于产生所述番茄种质资源的繁殖材料。本发明还涉及提供产生这种抗性番茄种质资源的方法以及鉴定和选择这种种质资源的方法，包含产生或者可再生成番茄褐皱果病毒抗性的番茄种质资源。

11、本发明所选的植物是栽培番茄植物，其具有改进的农艺性状，使其适用于农业生产栽培。本发明还涉及从本发明的番茄植物中收获的果实，其中番茄果实在其基因组中包含本发明的tbr5基因。

12、本发明还涉及培育具有tobrfv抗性的栽培番茄植物的育种方法，包含适于产生本发明的番茄植物的繁殖材料，其中所述繁殖材料适于有性繁殖，并且包含选自小孢子、花粉、子房、胚珠、胚囊和卵细胞；或者适于营养繁殖，并且包含选自插条、根、茎、细胞、原生质体；或者适于可再生细胞的组织培养；或者选自叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、分生组织细胞、根、根尖、花药、花、种子和茎；本发明的植物可用作繁殖材料的来源。

13、本发明的优点：

14、本发明找到了两个新的与番茄褐色皱纹果病毒抗性相关的snp位点，该位点可为最终实现对tbr5基因的克隆，进而为褐色皱纹果病毒抗性的分子机制研究奠定基础。可直接用于番茄抗褐色皱纹果病毒材料的分子标记辅助育种，而由于分子标记在辅助育种体系中具有简便、快速、高通量的优势，因而本发明所提供的分子标记在抗褐色皱纹果病毒新品种培育中具有较好的应用价值。

15、本发明通过基因编辑技术获得tbr5基因编辑株系，结果发现，通过和野生型相比，所述tbr5基因编辑株系对褐色皱纹果病毒的抗性增强，也就是说对tbr5基因进行编辑后赋予其对tobrfv的抗性。该基因新功能的发现，为番茄抗褐色皱纹果病毒新品种的育种具有重要的指导意义。