抗人钙卫蛋白的单克隆抗体组合物及应用的制作方法

本发明属于抗体的制备及序列测定领域，具体涉及抗人钙卫蛋白的单克隆抗体组合物及应用。

背景技术：

1、钙卫蛋白，又称mrp8-mrp14、卡尔钙调蛋白a和b、囊性纤维化抗原等，是哺乳动物蛋白s100a8/a9的复合物，属于s100家族，广泛分布于人体细胞，组织和体液中。钙卫蛋白以s100a8/a9异二聚体或异四聚体的形式存在，具有抗微生物、促炎症和促血栓形成的特性，人钙卫蛋白分子量大小约为24 kda，由蛋白单体 s100a8（10,835 da）和 s100a9（13,242da）组成。在钙离子存在下，钙卫蛋白能够通过螯合作用结合过渡金属铁、锰和锌，这种金属螯合赋予钙卫蛋白抗微生物特性。

2、钙卫蛋白检测的临床意义：

3、1. 血清学钙卫蛋白检测：

4、血清钙卫蛋白的检测在临床上相对较少，通常用于评估全身性炎症状态，尤其是与风湿性疾病、全身性感染和白血病等相关的情况。血清钙卫蛋白水平的升高可能暗示全身性炎症的存在，但对于评估肠道炎症活动程度不如粪便检测的钙卫蛋白直接、准确。

5、2. 评估肠道炎症和炎症性肠病（ibd）的活动程度：

6、钙卫蛋白主要用于评估肠道炎症的程度，如溃疡性结肠炎和克罗恩病。炎症活动时，肠道黏膜受损，导致钙卫蛋白释放增加。检测粪便中的钙卫蛋白能够客观反映肠道黏膜的炎症程度，为评估炎症性肠病的活动程度提供依据。

7、3 鉴别炎症性肠病和非炎症性肠疾病：

8、钙卫蛋白检测有助于鉴别肠道炎症性疾病（如炎症性肠病）和非炎症性肠疾病，如功能性胃肠疾病（如肠易激综合征），以确保正确的诊断和治疗方案。

9、钙卫蛋白的粪便检测具有非侵入性、敏感性高、特异性强和操作简便等优点，已成为评估肠道炎症的重要工具，对临床医生制定个性化治疗方案、监测疾病进展和预后评估具有重要帮助。

10、综合来说，血清钙卫蛋白和粪便钙卫蛋白检测在临床上具有广泛的应用价值，能够提供重要的辅助诊断、治疗监测和预后评估信息，有助于医生制定更合理的治疗方案，改善患者的生存率和生活质量。

11、开发性能优异的钙卫蛋白免疫诊断试剂的核心原料是一株特异性识别鼠抗人钙卫蛋白s100a8/a9 复合物构象表位的单克隆抗体和一株特异性识别人钙卫蛋白s100a8亚基或者s100a9亚基的抗体，单克隆抗体以人钙卫蛋白s100a8/a9 复合物为免疫原，人钙卫蛋白s100a8亚基和s100a9亚基作为筛选原，筛选高亲和力的单克隆抗体同时，还需要确保特异性识别鼠抗人钙卫蛋白s100a8/a9 复合物的单克隆抗体不识别单独的人钙卫蛋白s100a8亚基和s100a9亚基，从而提高诊断试剂的特异性和灵敏度，对于钙卫蛋白临床诊断具有很大的临床意义。市面上鼠抗钙卫蛋白单克隆抗体质量良莠不齐，无法兼顾高亲和力和特异性。

技术实现思路

1、为解决亲和力和特异性的问题，本发明提供了抗人钙卫蛋白的单克隆抗体组合物。具有高亲和力的单克隆抗体序列，且抗体性能优异、准确性高。同时提供了基于上述钙卫蛋白化学发光测定试剂盒。

2、本发明提供如下技术方案：

3、抗人钙卫蛋白的单克隆抗体组合物，包括1号克隆和2号克隆，

4、1号克隆的重链可变区氨基酸序列：

5、evqlqqsgpelvkpgasvemsckasgytftsyvmhwvkqkpgqglewigyinpynydtkynekfkgkasltsdkssstaymelssltsedsavyyctrggdfdywgqgttltvss

6、1号克隆的轻链可变区氨基酸序列：

7、qavviqesalttspgetvtltcrsstgavttsnyanwvqekpdhlftgliggsnnrapgvparfsgsligdkaaltitgaqtedeaiyfcgllysnnwvfgggtkltvl

8、2号克隆的重链可变区氨基酸序列：

9、evqlqqsgpelvkpgasvkmsckasgytftlyvihwvkqkpgqglewigyinpyidgtkynekfkgkatltsdkssstafmelssltsedsavyycarsgygnyglawlaywgqgtlvtvsa

10、2号克隆的轻链可变区氨基酸序列：

11、qivltqspaimsaslgervtmtctasssvypsylywyqqkpgsspklwiyttsnlasgvparfsgsgsgtsysltissmeaedaatyychqyhrsrtfgggtkleik

12、抗人钙卫蛋白的单克隆抗体组合物的制备方法，具体步骤包括：

13、s1、人钙卫蛋白s100a8亚基、s100a9亚基和s100a8/a9 复合物的表达生产：

14、s11、人钙卫蛋白s100a8亚基表达生产

15、将密码子已经优化成大肠杆菌偏好的密码子的s100a8基因导入pet30a表达质粒，转化到大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，挑取单菌落分别进行诱导表达，在含有卡那霉素的lb培养基中培养，培养至od600nm至0.6-0.8时，加入iptg进行诱导表达后分别收集菌体；

16、s12、人钙卫蛋白s100a9亚基表达生产

17、将密码子已经优化成大肠杆菌偏好的密码子的s100a9基因导入pet30a表达质粒，转化到大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，挑取单菌落分别进行诱导表达，在含有卡那霉素的lb培养基中培养，培养至od600nm至0.6-0.8时，加入iptg进行诱导表达后分别收集菌体；

18、s13、人钙卫蛋白s100a8/a9 复合物

19、将密码子已经优化成大肠杆菌偏好的密码子的s100a9亚基基因和s100a8亚基基因分别导入prsfduet-1载体多克隆位点1和多克隆位点2，构建双表达载体质粒，转化到大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，挑取单菌落进行诱导表达，在含有卡那霉素的lb培养基中培养，培养至od600nm至0.6-0.8时，加入iptg进行诱导表达后收集菌体。

20、s2、人钙卫蛋白s100a8亚基、s100a9亚基和s100a8/a9 复合物的纯化：

21、s21、人钙卫蛋白s100a8亚基的纯化

22、菌体用磷酸盐缓冲液重悬，高压均质机进行高压均质后，离心取上清，用预装柱nismart-6ff beads进行亲和纯化，用梯度咪唑浓度进行洗杂和洗脱，sds-page跑胶检测蛋白纯度，将蛋白透析至磷酸盐缓冲液中，0.22um滤器无菌过滤后，bca测定蛋白浓度；

23、s22、人钙卫蛋白s100a9亚基的纯化

24、菌体用磷酸盐缓冲液重悬，高压均质机进行高压均质后，离心取上清，用预装柱nismart-6ff beads进行亲和纯化，用梯度咪唑浓度进行洗杂和洗脱，sds-page跑胶检测蛋白纯度，将蛋白透析至磷酸盐 缓冲液中，0.22um滤器无菌过滤后，bca测定蛋白浓度；

25、s23、人钙卫蛋白s100a8/a9 复合物的纯化

26、第一步：纯化s100a9亚基

27、菌体用磷酸盐缓冲液重悬，高压均质机进行高压均质后，离心取上清，用预装柱nismart-6ff beads进行亲和纯化，用磷酸盐缓冲液洗杂，用500mm咪唑浓度直接一步洗脱，收集洗脱液；

28、第二步：纯化s100a8亚基

29、将收集好的洗脱液,离心取上清，用预装柱streptactin beads 4ff进行亲和纯化，用磷酸盐缓冲液洗杂，用2.5mm脱硫生物素浓度洗脱，收集洗脱液，sds-page跑胶检测蛋白纯度，将蛋白透析至磷酸盐缓冲液中，0.22μm滤器无菌过滤后，bca测定蛋白浓度。

30、s3、单克隆抗体的制备：

31、将亲和纯化后的人钙卫蛋白s100a8/a9 复合物与弗氏佐剂进行等体积混合乳化，免疫计量为100ug/只小鼠，3周后进行加强免疫，免疫计量为50ug/只小鼠，后期间隔2周每次，采集小鼠血液分离血清，酶联免疫吸附测定抗体效价，筛选免疫较好的小鼠进行杂交瘤融合实验，经过hat筛选培养基筛选培养后，取上清进行酶联免疫吸附测定，利用亲和纯化后的人钙卫蛋白s100a8亚基、s100a9亚基和s100a8/a9 复合物筛选特异性针对人钙卫蛋白s100a8亚基、s100a9亚基和s100a8/a9 复合物的抗体，并进行两轮的细胞亚克隆，克隆出单克隆细胞株，用无血清培养和发酵细胞株，收集培养上清。

32、抗人钙卫蛋白的单克隆抗体组合物在制备检测钙卫蛋白的试剂中的应用。单克隆抗体组合物用于制备检测钙卫蛋白的化学发光试剂盒。

33、钙卫蛋白化学发光测定试剂盒，使用1号克隆和2号克隆分别作为包被抗体和检测抗体。

34、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

35、本发明提供了抗人钙卫蛋白，用于制备诊断用单克隆抗体，本发明的抗人钙卫蛋白的单克隆抗体组合物包括1号克隆和2号克隆，能特异性识别鼠抗人钙卫蛋白s100a8/a9复合物的单克隆抗体不识别单独的人钙卫蛋白s100a8亚基和s100a9亚基，此抗体组合具有特异性和高亲和力的特点，同时也提供了基于上述抗体的钙卫蛋白化学发光测定试剂盒，从而提高诊断试剂的特异性和灵敏度，对于肿瘤的早期发现具有很大的临床意义。