一种改性聚多巴胺磁性纳米材料及其制备方法和应用

本技术涉及糖肽富集及糖基化修饰鉴定，尤其涉及一种改性聚多巴胺磁性纳米材料及其制备方法和应用。

背景技术：

1、糖基化修饰是蛋白质非常重要的翻译后修饰之一，约有50％以上的蛋白质会参与糖基化修饰。蛋白的糖基化修饰会影响其折叠、聚合、成熟及运输过程，并参与免疫、内吞、分泌、物质转运、信号转导等多种生命活动过程，在细胞间相互作用、免疫防御、细胞生长和分化等多种生物过程中发挥重要的结构和功能作用。异常的糖基化修饰与癌症、自身免疫性疾病、呼吸系统疾病等多种人类重大疾病的发生具有密切联系，糖基化修饰分型的鉴定对疾病预后、诊断和药物治疗反应判断具有重要意义。此外，蛋白类生物药物的糖基化修饰可以决定蛋白构型、稳定性、溶解性、生物学功能等关键质量属性。由此可见，蛋白质糖基化分析在生物医学研究和生物技术产业均具有重要应用前景。目前，生物质谱技术是解析蛋白质糖基化修饰的常用手段，但由于糖肽丰度低、糖链极性大；离子化效率较低，质谱信号常常受到非糖肽的抑制，严重干扰糖肽的检测。因此，在质谱分析前研发低成本、灵敏度高、特异性强的完整糖肽富集方法是非常必要的。

2、目前常用的糖肽富集方法主要有凝集素法、肼化学法、硼酸法及亲水相互作用法等。

3、其中，凝集素法的选择性较好，但成本高、通用性差；肼化学法可以选择性的富集糖肽，反应条件相对剧烈，糖链容易在富集过程中损失；硼酸法能与顺式邻二醇形成硼酸酯结构以捕获糖肽，但这种方法耗时较长。相比之下，因糖链具有高亲水性，亲水相互作用色谱可通过与糖肽形成氢键、静电作用等非共价键作用来捕获完整糖肽，糖肽富集过程不涉及化学反应，操作简单，重现性好，不破坏寡糖结构，近年来得到了较好的发展。不过，这一方法容易受到极性相当的非糖肽的干扰，因此需要合成并筛选高选择性的亲水富集材料。固相萃取磁珠是近年来新兴的分离纯化材料，经适宜的官能团修饰可快速实现物质的分离。聚多巴胺是一种具有自聚集性质的高亲水仿生材料，通过对它的表面改性可实现完整糖肽的高选择性、高灵敏度、高通量的富集。

4、因此，如何对聚多巴胺进行表面改性是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种不破坏聚糖结构，可高效、特异、灵敏富集糖肽聚糖或糖苷的低成本改性聚多巴胺磁性纳米材料及其制备方法和应用。

2、为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种改性聚多巴胺磁性纳米材料的制备方法，包括以下步骤：

4、(1)制备纳米磁珠；

5、(2)制备聚多巴胺纳米磁珠；

6、(3)将二亚乙基三胺溶于n,n-二甲基甲酰胺中，加入n,n-羰基二咪唑，室温振荡进行反应，得到二亚乙基三胺氨基甲酰咪唑；

7、(4)将聚多巴胺纳米磁珠分散在n,n-二甲基甲酰胺中，加入二亚乙基三胺和二亚乙基三胺氨基甲酰咪唑，室温振荡进行反应，磁分离后弃上清，用n,n-二甲基甲酰胺洗涤，置于水中分散完全，干燥后得到聚脲修饰的聚多巴胺磁性纳米材料。

8、优选的，步骤(3)具体为：将0.1-10mmol二亚乙基三胺溶于2ml n,n-二甲基甲酰胺中，加入n,n-羰基二咪唑，n,n-羰基二咪唑与二亚乙基三胺的摩尔比为2：1，室温振荡反应10-60分钟。

9、优选的，步骤(4)具体为：将5-25mg聚多巴胺纳米磁珠分散在1mln,n-二甲基甲酰胺中，加入0.05-5mmol二亚乙基三胺和1ml二亚乙基三胺氨基甲酰咪唑，室温振荡反应4-20小时，磁分离后弃上清，用n,n-二甲基甲酰胺洗涤多次，置于水中分散3小时以上，置于烘箱50-70℃干燥，得到聚脲修饰的聚多巴胺磁性纳米材料。

10、采用上述技术方案的有益效果在于：在本发明限定的比例的反应体系下制得的改性聚多巴胺磁性纳米材料中聚脲修饰的聚多巴胺包覆厚度和其富集糖肽或聚糖的效果最佳。

11、优选的，步骤(1)具体为：将六水合三氯化铁溶于乙二醇中并搅拌至溶液呈黄褐色，向溶液中加入无水乙酸钠并继续搅拌1小时，然后转移至反应釜于烘箱中200℃加热16小时，将产物清洗并在烘箱中烘干，制得四氧化三铁纳米磁珠。

12、优选的，步骤(2)具体为：将10-50mg多巴胺溶解于10ml ph 8.8tris-hcl中，加入纳米磁珠，避光搅拌8-24h，产物清洗并在烘箱中50-70℃烘干，得聚多巴胺磁珠；

13、产物清洗方法为n,n-二甲基甲酰胺和水交替洗三遍，然后n,n-二甲基甲酰胺洗两遍。

14、本发明还公开了由上述所述的制备方法制备得到的一种改性聚多巴胺磁性纳米材料在糖肽富集与质谱鉴定中的应用。

15、一种用于富集糖肽的试剂盒，包括上述改性聚多巴胺磁性纳米材料和乙腈-甲酸水溶液；

16、所述乙腈-甲酸水溶液中乙腈的体积分数为60-90％，甲酸的体积分数为0.1-2％；

17、所述改性聚多巴胺磁性纳米材料分散于乙腈-甲酸水溶液中，浓度为0.5-2mg/ml。

18、采用上述技术方案的有益效果在于：在本发明限定的上述比例范围内的乙腈-甲酸水溶液中，改性聚多巴胺磁性纳米材料均能很好地分散，且更有利于糖肽或聚糖的富集；同时，在本发明限定浓度的改性聚多巴胺磁性纳米材料的糖肽或聚糖的富集能力最佳。

19、本发明还提供了一种富集糖肽的方法，包括以下步骤：

20、s1、将上述试剂盒中的分散液加入到目标糖肽溶液中，置于混匀仪中振荡富集糖肽；

21、s2、利用磁分离方法吸附改性聚多巴胺磁性纳米材料，去除富集液后，用体积分数为60％～90％乙腈水溶液洗涤改性聚多巴胺磁性纳米材料；

22、s3、向富集糖肽的改性聚多巴胺磁性纳米材料中加入洗脱液进行振荡洗脱并进行磁分离，得到糖肽富集溶液。

23、优选的，在上述富集糖肽的方法中，步骤s1中所述的目标糖肽溶液为糖蛋白胰酶酶切产物，糖蛋白胰酶酶切产物包括但不限于牛胎球蛋白、转铁蛋白、免疫球蛋白g、核糖核酸酶b和触珠蛋白中的一种或几种胰酶酶切产物的混合物。

24、采用上述技术方案的有益效果在于：本发明从多种不同糖基化修饰蛋白或无糖基化修饰蛋白的角度考察改性聚多巴胺磁性纳米材料富集糖肽或聚糖的高特异性富集、高抗干扰能力和较广的应用范围。

25、优选的，在上述富集糖肽的方法中，步骤s1中所述振荡富集时间为0.5-2小时；

26、步骤s2中所述磁分离方法采用磁性物体对改性聚多巴胺磁性纳米材料进行吸附分离；所述磁性物体为钕铁硼强磁、软磁条、吸铁石或磁力架；

27、步骤s3中所述振荡洗脱时间为0.5-2小时；述洗脱液为去离子水。

28、采用上述技术方案有益效果在于：本发明限定的振荡时间范围和洗脱溶剂极性梯度内，富集到的糖肽纯度高、数量多、且质谱信号强；

29、不受离心机等设备限制，操作简便，可快速实现磁性固相萃取材料与溶液的彻底分离，提高实验效率。

30、本发明的有益效果：

31、与市售hilic固相萃取柱相比，本发明提供的糖肽富集材料廉价易得，操作简便，富集灵敏度高。采用本发明提供的方法进行富集，可以保持糖链和/或聚糖的结构信息，保留特定糖基化修饰位点信息，有利于后续的质谱检测，对重大疾病预警、疾病发展监测、预后评估、生物标志物筛查等意义重大；为复杂样本中糖肽鉴定和疾病生物标志物的筛查等提供了新技术和新方法。