用于治疗乙型肝炎病毒感染的核酸药物的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及用于治疗乙型肝炎病毒感染的核酸药物，更具体地，公开了用于抑制乙型肝炎病毒基因表达的sirna，和含有sirna的药物组合物与sirna缀合物，还公开了涉及这些sirna、药物组合物与sirna缀合物的制备方法和用途。

背景技术：

1、乙型肝炎病毒(hepatitis b virus,hbv)是引起乙型肝炎(简称乙肝)的病原体，是一种嗜肝性、含有双链dna的病毒。虽然dna是遗传物质，但是复制循环涉及将前基因组rna复制到dna中的逆转录步骤。乙型肝炎病毒被归类为嗜肝病毒中的一员，属于嗜肝病毒科。人乙型肝炎病毒的原发感染会引起急性肝炎，伴有器官炎症、发热、黄疸和血液中肝转氨酶升高的症状。那些无法克服病毒感染的患者遭受多年的慢性疾病发展，患肝硬化或肝癌的风险增加。hbv主要的传播途径是血液传播(输血和血制品)。其次是母婴传播，慢性乙型肝炎患者中，40％～50％的患者均来源于母婴传播。第三是密切接触传播，如通过精液和阴道分泌物传播病毒。第四是医源性传播，如消毒不彻底、不安全注射等。

2、hbv被肝细胞摄取后，核衣壳被转移到细胞核中并释放dna。在细胞核中，完成dna链合成并对缺口进行修复，得到3.2kb的共价、闭合、环状(covalently closed circular,ccc)超螺旋dna(简称ccc dna)。cccdna作为五种主要病毒mrna转录的模板，其长度分别为3.5、3.5、2.4、2.1和0.7kb。所有mrna都是5’-封端且3’端处多聚腺苷酸化。在所有五种mrna之间的3’端处存在序列重叠。

3、其中一个3.5kb长度的mrna作为核心蛋白和聚合酶产生的模板。此外，该同一转录物用作前基因组复制中间体并允许病毒聚合酶启动逆转录产生dna。核衣壳的形成需要核心蛋白。另一3.5kb长度的mrna编码前核心蛋白，即可分泌的乙肝e抗原(hbeag)。在不存在复制抑制剂的情况下，血液中的e抗原丰度与肝脏中的乙型肝炎病毒复制相关，并且用作监测疾病进展的重要诊断标志物。

4、2.4kb和2.1kb长度的mrna携带前s1、前s2和s的开放阅读框(open readingframe,orf)，用于表达病毒的大、中和小表面抗原。乙肝表面抗原(hepatitis b surfaceantigen，hbsag)与感染性完整颗粒相关联。此外，感染患者的血液还含有仅来源于乙肝表面抗原的非感染性颗粒，不含基因组dna或聚合酶。血液中可检测的乙肝表面抗原的完全和持久消耗被认为是乙型肝炎病毒清除的可靠指标。

5、0.7kb长度的mrna编码s蛋白。该基因产物对于病毒基因的有效转录很重要，并且还充当宿主基因表达的反式激活因子。后一种活性似乎对肝癌发展过程中的肝细胞转化很重要。

6、hbv治疗的主要目标是永久地抑制hbv复制并改善肝脏疾病。临床上重要的短期目标是实现hbeag-血清转化、血清谷丙转氨酶(alt)和谷草转氨酶(ast)的正常化、肝脏炎症的消退以及防止肝失代偿。治疗的最终目标是获得持久的反应以防止发生肝硬化和肝癌从而延长生存期。由于感染肝细胞的细胞核中特定形式的病毒共价闭合环状dna的持续存在，因此无法完全消除hbv感染。然而，由治疗引起的血清hbsag的清除是慢性hbv感染终止的标志，并且与最佳长期结果相关。

7、目前被批准上市的抗hbv药物主要是免疫调节剂(干扰素-α和聚乙二醇干扰素-α-2α)和抗病毒治疗药物(拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦、克拉夫定等)。其中，抗病毒治疗药物属于核苷酸类药物，其作用机制是抑制hbv dna的合成，并不能直接减少hbsag水平。与延长治疗一样，核苷酸类药物显示hbsag清除速度类似于自然观察结果。

8、临床己有降低hbsag的疗法，但疗效不佳。因此，若能从基因水平沉默病毒的基因表达，阻断hbv的生成和复制，特别是hbsag和hbeag的产生，可从根本上降低病毒代谢和对肝细胞的侵染。小干扰rna(small interfering rna,sirna)可基于rna干扰(rnainterference,rnai)这一机制，以序列特异性的方式抑制或阻断靶标目的基因的表达，从mrna翻译至蛋白这一层次发挥抑制作用，从而达到治疗疾病的目的。

9、因此，在尚无可在大部分患者中恢复对hbv的免疫控制的任何现行治疗方案的情况下，需要针对hbv感染的有效治疗，该治疗可在大多数患者中抑制病毒复制并恢复免疫控制。因此，在本领域中需要用于感染hbv或患有hbv相关疾病的受试者的替代疗法和联合疗法。

技术实现思路

1、发明要解决的问题

2、本发明提供的如下sirna及其修饰序列能够特异性地抑制乙型肝炎病毒基因表达，含有sirna的药物组合物或sirna缀合物能够特异性地靶向肝脏，从而可以抑制乙型肝炎病毒基因表达，实现乙型肝炎病毒感染相关联的疾病和/或病症的治疗。

3、用于解决问题的方案

4、本发明第一方面提供了一种sirna，其中，所述sirna含有正义链和反义链，所述sirna中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中，所述正义链含有一段核苷酸序列i，所述反义链含有一段核苷酸序列ii，所述核苷酸序列i和所述核苷酸序列ii至少部分地反相互补形成双链区，所述核苷酸序列i和所述核苷酸序列ii选自如下i)-iii)所示序列中的一组：

5、i)所述核苷酸序列i与seq id no:1所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列ii与seq id no:2所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异；

6、ii)所述核苷酸序列i与序列iii所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列ii与seq id no:3所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异；

7、iii)所述核苷酸序列i与序列v所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列ii与seq id no:4所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异；

8、在一些实施方案中，所述核苷酸序列i与seq id no:1所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列ii与seq id no:2所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异；

9、或者，所述核苷酸序列i与序列iii所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列ii与seq id no:3所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异；

10、或者，所述核苷酸序列i与序列v所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列ii与seq id no:4所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异；

11、在一些优选的实施方案中，所述核苷酸序列i如seq id no:1所示；和/或所述核苷酸序列ii如seq id no:2所示；

12、或者，所述核苷酸序列i如序列iii所示；和/或所述核苷酸序列ii如seq id no:3所示；

13、或者，所述核苷酸序列i如序列v所示；和/或所述核苷酸序列ii如seq id no:4所示。

14、在一些实施方案中，所述sirna针对乙型肝炎病毒s蛋白。

15、在一些优选的实施方案中，所述sirna针对乙型肝炎病毒s蛋白的保守区间。

16、在一些更优选的实施方案中，所述保守区间为相对于genbank注册号为u95551.1的dna的第258位至第278位核苷酸，和/或第684位至第704位核苷酸，和/或第688位至第708位核苷酸。

17、在一些实施方案中，所述正义链和/或所述反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基。

18、在一些实施方案中，所述正义链和/或所述反义链中的每一个核苷酸独立地为氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸。

19、在一些具体的实施方案中，所述非氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸的核糖基2’位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物中的一种。

20、在一些更具体的实施方案中，所述核苷酸的核糖基2’位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸选自2’-烷氧基修饰的核苷酸、2’-经取代的烷氧基修饰的核苷酸、2’-烷基修饰的核苷酸、2’-经取代的烷基修饰的核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-经取代的氨基修饰的核苷酸、2’-脱氧核苷酸中的一种；

21、所述核苷酸类似物选自异核苷酸、式(6)所示的lna、式(7)所示的ena、式(8)所示的cetbna、式(9)所示的una和式(10)所示的gna中的一种；

22、

23、其中，式(6)至式(10)中，base表示碱基；式(9)和式(10)中，ra选自h、oh或烷氧基。

24、在一些更具体的实施方案中，所述的非氟代修饰的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，所述甲氧基修饰的核苷酸指核糖基的2’-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。

25、在一些具体的实施方案中，所述具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基。

26、在一些更具体的实施方案中，所述具有修饰基团的磷酸酯基为具有如式(13)所示结构的硫代磷酸酯基：

27、

28、本发明第二方面提供了一种sirna缀合物，所述sirna缀合物含有本发明第一方面中所述的sirna以及缀合连接至该sirna的缀合基团。

29、在一些实施方案中，所述缀合基团包含药学上可接受的靶向基团和接头，并且，所述sirna、所述接头和所述靶向基团依次共价或非共价连接。

30、在一些具体的实施方案中，所述接头具有如式(19)所示的结构：

31、

32、其中，m为1-3的整数；

33、la是具有如式(20)所示结构的包含酰胺键的链状部分，每个所述la在其两端分别与一个所述靶向基团和所述lc部分通过醚键相连接：

34、

35、lb是具有如式(21)所示结构的包含n-酰基吡咯烷的链状部分，所述链状部分在其一端具有羰基并与所述lc部分通过酰胺键相连接，在另一端具有氧原子并与所述sirna通过磷酸酯键相连接：

36、

37、lc是基于羟甲基氨基甲烷、二羟甲基氨基甲烷或三羟甲基氨基甲烷的2-4价连接基团，所述lc经由氧原子与各个所述la部分通过醚键相连接，并且经由氮原子与所述lb部分通过酰胺键相连接。

38、在一些具体的实施方案中，所述sirna缀合物具有如式(23)所示的结构：

39、

40、其中，双螺旋结构表示所述sirna。

41、在一些具体的实施方案中，所述接头连接至所述sirna的正义链3’末端或正义链5’末端。

42、在一些实施方案中，所述缀合物具有式(24)、(25)或(26)所示的结构：

43、

44、其中，r2为式(s1)所示结构的基团：

45、

46、其中，e1为oh或sh,nu为权利要求1-11中任一项所述的sirna；

47、r1是长度为1-20个碳原子的直链亚烷基或环状亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：c(o)、nh、o、s、ch＝n、s(o)2、c2-c10亚烯基、c2-c10亚炔基、c6-c10亚芳基、c3-c18亚杂环基和c5-c10亚杂芳基；

48、并且其中r1可任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：c1-c10烷基、c6-c10芳基、c5-c10杂芳基、c1-c10卤代烷基、-oc1-c10烷基、-oc1-c10烷基苯基、-c1-c10烷基-oh、-oc1-c10卤代烷基、-sc1-c10烷基、-sc1-c10烷基苯基、-c1-c10烷基-sh、-sc1-c10卤代烷基、卤素取代基、-oh、-sh、-nh2、-c1-c10烷基-nh2、-n(c1-c10)烷基(c1-c10烷基)、-nh(c1-c10烷基)、-n(c1-c10烷基)(c1-c10烷基苯基)、-nh(c1-c10)烷基苯基)、氰基、-co2h、c(o)o(c1-c10)烷基)、-con(c1-c10)烷基(c1-c10烷基)、-conh(c1-c10)烷基、-conh2、-nhc(o)(c1-c10)烷基)、-nhc(o)(苯基)、-n(c1-c10)烷基、-n(c1-c10烷基)c(o)(c1-c10)烷基)、-n(c1-c10)烷基)c(o)(苯基)、-c(o)c1-c10烷基、-c(o)c1-c10烷基苯基、-c(o)c1-c10卤烷基、-oc(o)c1-c10烷基、-so2(c1-c10)烷基、-so2(苯基)、-so2(c1-c10)卤代烷基)、-so2nh2、-so2nh(c1-c10烷基)、-so2nh(苯基)、-nhso2(c1-c10)烷基)、-nhso2(苯基)和-nhso2(c1-c10)卤代烷基)；

49、每个l1独立地是长度为1-40个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：c(o)、nh、o、s、ch＝n、s(o)2、c2-c10亚烯基、c2-c10亚炔基、c6-c10亚芳基、c3-c18亚杂环基和c5-c10亚杂芳基；并且其中r1可任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：c1-c10烷基、c6-c10芳基、c5-c10杂芳基、c1-c10卤代烷基、-oc1-c10烷基、-oc1-c10烷基苯基、-c1-c10烷基-oh、-oc1-c10卤代烷基、-sc1-c10烷基、-sc1-c10烷基苯基、-c1-c10烷基-sh、-sc1-c10卤代烷基、卤素取代基、-oh、-sh、-nh2、-c1-c10烷基-nh2、-n(c1-c10)烷基(c1-c10烷基)、-nh(c1-c10烷基)、-n(c1-c10烷基)(c1-c10烷基苯基)、-nh(c1-c10)烷基苯基)、氰基、-co2h、c(o)o(c1-c10)烷基)、-con(c1-c10)烷基(c1-c10烷基)、-conh(c1-c10)烷基、-conh2、-nh c(o)(c1-c10)烷基)、-nhc(o)(苯基)、-n(c1-c10)烷基、-n(c1-c10烷基)c(o)(c1-c10)烷基)、-n(c1-c10)烷基)c(o)(苯基)、-c(o)c1-c10烷基、-c(o)c1-c10烷基苯基、-c(o)c1-c10卤烷基、-oc(o)c1-c10烷基、-so2(c1-c10)烷基、-so2(苯基)、-so2(c1-c10)卤代烷基)、-so2nh2、-so2nh(c1-c10烷基)、-so2nh(苯基)、-nhso2(c1-c10)烷基)、-nhso2(苯基)和-nhso2(c1-c10)卤代烷基)；

50、m1表示靶向基团；

51、表示基团共价连接的位点。

52、在一些具体的实施方案中，每个l1独立地选自于由基团a1-a14基团及任意组合所组成的组：

53、

54、其中，每个k1独立地为1-20的整数；

55、每个k2独立地为1-20的整数；

56、每个rc独立地为c1-c10烷基；

57、每个rd选自于由a15-a19及其任意组合所组成的组：

58、

59、每个re独立地为c1-c10烷基；表示基团共价连接的位点。

60、在一些具体的实施方案中，l1选自于由基团a1、a4、a5、a6、a8、a10、a11、a13及其连接组合所组成的组。

61、在一些具体的实施方案中，l1为基团a1、a4、a8、a10、a11中至少2个的连接组合。

62、在一些更具体的实施方案中，其中，l1的长度为3-20个原子。

63、在一些更具体的实施方案中，其中k1为2-10的整数，k2为2-10的整数，rc为c1-c4烷基，rd为a15、a16、a17、a18、a19的一种，re为c1-c5烷基。

64、在一些更具体的实施方案中，k1为3-5的整数，k2为3-5的整数，rc为甲基、乙基和异丙基中的一种，rd为a15或a16，re为甲基、乙基、异丙基和丁基中的一种。

65、在一些更具体的实施方案中，每个所述靶向基团独立地为与哺乳动物肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体亲和的配体。

66、在一些更具体的实施方案中，每个所述靶向基团独立地选自d-半乳糖、l-半乳糖、α-d-吡喃葡萄糖、β-d-吡喃葡萄糖、α-d-呋喃葡萄糖、β-d-呋喃葡萄糖、α-d-呋喃果糖、α-d-吡喃果糖、α-d-吡喃半乳糖、β-d-吡喃半乳糖、α-d-呋喃半乳糖、β-d-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、n-乙酰半乳糖胺、n-三氟乙酰半乳糖胺、n-丙酰半乳糖胺、n-正丁酰半乳糖胺、n-异丁酰半乳糖胺中的一种。

67、在一些更具体的实施方案中，至少一个或每个所述靶向基团为半乳糖或n-乙酰半乳糖胺。

68、在一些更具体的实施方案中，r1上同时含有与含氮骨架上的n原子连接的连接位点和与r2中的p原子连接的连接位点。

69、在一些更具体的实施方案中，r1上所述与含氮骨架上的n原子连接的连接位点与n原子形成酰胺键，所述与r2中的p原子连接的连接位点与p原子形成磷酸酯键或硫代磷酸酯键。

70、在一些更具体的实施方案中，所述r2中的p原子连接到所述sirna正义链或反义链的末端。

71、在一些更具体的实施方案中，所述r2中的p原子通过磷酸二酯键连接至所述sirna中的核苷酸的2’位、3’位或5’位。

72、本发明的第三方面提供了一种细胞，其包含本发明第一方面中所述的sirna，和/或本发明第二方面中所述的sirna缀合物。

73、本发明的第四方面提供了一种药物组合物，其包含本发明第一方面中所述的sirna，和/或本发明第二方面中所述的sirna缀合物，以及药用赋形剂。

74、本发明的第五方面提供了本发明第一方面中所述的sirna，本发明第二方面中所述的sirna缀合物和/或本发明的第四方面中所述的药物组合物在制备用于治疗乙型肝炎病毒感染相关联的疾病和/或病症药物中的用途。

75、在一些任选的实施方案中，所述的乙型肝炎病毒感染相关联的疾病和/或病症是慢性乙型病毒性肝炎或急性乙型病毒性肝炎。

76、本发明的第六方面提供了一种治疗乙型肝炎病毒感染相关联的疾病和/或病症的方法，其中，所述方法包括将有效量的本发明第一方面中所述的sirna，本发明第二方面中所述的sirna缀合物和/或本发明的第四方面中所述的药物组合物给予患有乙型肝炎病毒感染相关联的疾病和/或病症的受试者。

77、在一些任选的实施方案中，所述的乙型肝炎病毒感染相关联的疾病和/或病症是慢性乙型病毒性肝炎或急性乙型病毒性肝炎。

78、本发明的第七方面提供了一种抑制细胞中乙型肝炎病毒表达的方法，该方法包括将有效量的本发明第一方面中所述的sirna，本发明第二方面中所述的sirna缀合物和/或本发明第四方面中所述的药物组合物与所述细胞接触，从而抑制所述细胞中所述乙型肝炎病毒的复制。

79、发明的效果

80、本发明提供的sirna针对乙型肝炎病毒s蛋白的保守区间，通过从ncbi数据库下载2683个中国乙肝病人的hbv完整基因组序列，采用clustalw算法进行多重比对，然后用在线软件meme分析获得。因此，本发明所设计的sirna广泛适于不同类型/突变的hbv病毒，尤其适于在中国地区出现的各类型或突变的hbv病毒。

81、本发明提供的sirna、药物组合物和sirna缀合物具有良好的稳定性，较高的乙型肝炎病毒mrna抑制活性，较低的脱靶效应，和/或能显著治疗乙型肝炎病毒感染相关联的疾病和/或病症。

82、在一些实施方案中，本发明提供的sirna、药物组合物或sirna缀合物在体外实验中显示出优异的靶基因抑制活性。在一些实施方案中，本发明提供的sirna、药物组合物或sirna缀合物在肝细胞中显示出至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的靶基因表达抑制率。

83、本发明提供的sirna、药物组合物或sirna缀合物未显示出明显脱靶效应。脱靶效应可以是例如抑制非靶基因的基因正常表达。据认为，如果脱靶基因表达的结合/抑制与在靶基因效果相比低于50％、40％、30％、20％或10％时，该脱靶效应就是不显著的。

84、由此说明，本发明提供的sirna、药物组合物以及sirna缀合物能够抑制乙型肝炎病毒基因的表达，有效治疗乙型肝炎病毒感染相关联的疾病和/或病症，具有良好的应用前景。

85、本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。