嵌合抗原受体、慢病毒、修饰T细胞及其应用的制作方法

本发明属于生物医药，具体涉及嵌合抗原受体、慢病毒、修饰t细胞及其应用。

背景技术：

1、嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)是一种融合蛋白，由细胞内信号转导区(如cd3ζ)、跨膜区和胞外抗体单链可变区片段(single chain fragmentvariable，scfv)组成。cars的特异性主要由胞外scfv区决定，它能够特异性识别肿瘤抗原，传递抗原信号，从而活化car-t细胞发挥其细胞毒效应。这是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，近几年通过优化改良在临床肿瘤治疗上取得很好的效果，是一种非常有前景的，能够精准、快速、高效，且有可能治愈癌症的新型肿瘤免疫治疗方法。

2、car-t治疗又称嵌合抗原受体t细胞治疗，是将人的t细胞经过基因工程手段体外修饰改造后，从而可特异性识别和结合肿瘤细胞表面的抗原并实现对肿瘤细胞的特异性杀伤，将其回输患者体内，用于治疗疾病。

3、car-t细胞的生产过程包括t细胞的初始分离和富集，cart细胞制备，包括t细胞活化，t细胞扩增，使用病毒或非病毒载体进行car载体的基因转移。而慢病毒载体都被认为是安全有效的，它可以随机整合到宿主t细胞基因组中。慢病毒表达载体，即通常所说的穿梭载体，包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装rna到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。

4、cd5分子是一种单链跨膜蛋白，包括一个大约369个氨基酸残基的外显区域、一个跨膜区域和一个小约50个氨基酸残基的胞内区域。外显区域包括3个ig-like结构域，其中第一个结构域与其他ig-like结构域有所不同。cd5是一种泛t细胞标记物，它在t细胞的发育、激活和功能调控中起着重要作用。cd5在大多数t细胞恶性肿瘤中普遍过表达，因此cd5分子有望成为t细胞恶性肿瘤的一个理想靶点。但是，正常的效应t细胞和t细胞肿瘤都表达cd5抗原会导致cd5-car-t细胞的自相残杀，cd5 car-t细胞很难在体外制备成功。因此需要开发一种有效减少靶向cd5 car-t细胞自杀的嵌合抗原受体。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明采用人源化的纳米抗体作为car抗原的识别域，并通过cd5结合域在内质网锚定的方法阻止cd5蛋白在细胞内表达过程中转运到细胞表面有效地降低cd5在细胞表面的表达，并最大限度地减少了靶向cd5car-t细胞的自杀现象，其优势在于可以在体内长期存活，从而达到更好的疗效。

2、一方面，本发明提供了一种靶向cd5分子的嵌合抗原受体，所述的嵌合抗原受体包括5dsdab单域抗体；所述的5dsdab单域抗体包括重链可变区cdr1、cdr2和cdr3；所述的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列如seq id no.15-seq id no.17所示。

3、具体地，所述的5dsdab单域抗体的氨基酸序列为seq id no.1或与seq id no.1具有85％同源性的序列。

4、优选地，所述的5dsdab单域抗体的氨基酸序列为seq id no.1或与seq id no.1具有90％同源性的序列。

5、进一步优选地，所述的5dsdab单域抗体的氨基酸序列为seq id no.1或与seq idno.1具有95％同源性的序列。

6、进一步优选地，所述的5dsdab单域抗体的氨基酸序列为seq id no.1或与seq idno.1具有98％同源性的序列。

7、更进一步优选地，所述的5dsdab单域抗体的氨基酸序列为seq id no.1。

8、具体地，所述的嵌合抗原受体还包括但不限于：信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞浆区。

9、具体地，所述的胞浆区选自cd8、4-1bb和cd3ζ中的至少一种。

10、具体地，所述的嵌合抗原受体还包括自剪切区和滞留域。

11、具体地，所述的嵌合抗原受体由以下模块依次串联得到：cd8分子的信号肽，5dsdab单域抗体，cd8 hinge+tm区，4-1bb胞浆区，cd3ζ分子的胞浆区，t2a自剪切区，5dsdab单域抗体，er滞留域。

12、进一步具体地，所述的cd8分子的信号肽的氨基酸序列如seq id no.2所示；所述的cd8 hinge+tm区的氨基酸序列如seq id no.3所示；所述的4-1bb胞浆区的氨基酸序列如seq id no.4所示；所述的cd3ζ分子的胞浆区的氨基酸序列如seq id no.5所示；所述的t2a自剪切区的氨基酸序列如seq id no.6所示；所述的er滞留域的氨基酸序列如seq id no.7所示。

13、具体地，所述的嵌合抗原受体的氨基酸序列如seq id no.9所示。

14、又一方面，本发明提供了一种表达前述的嵌合抗原受体的核酸。

15、具体地，所述的核酸序列如seq id no.8所示或与seq id no.8具有80％以上序列同源性的序列。

16、优选地，所述的核酸序列如seq id no.8所示或与seq id no.8具有85％以上序列同源性的序列。

17、进一步优选地，所述的核酸序列如seq id no.8所示或与seq id no.8具有90％以上序列同源性的序列。

18、更进一步优选地，所述的核酸序列如seq id no.8所示或与seq id no.8具有95％以上序列同源性的序列。

19、最进一步优选地，所述的核酸序列如seq id no.8所示或与seq id no.8具有98％以上序列同源性的序列。

20、又一方面，本发明提供了一种慢病毒，所述的慢病毒包括前述的嵌合抗原受体或前述的核酸。

21、又一方面，本发明提供了一种细胞，包含前述的嵌合抗原受体或前述的核酸或前述的慢病毒。

22、具体地，所述的细胞包括但不限于免疫效应细胞。

23、进一步具体地，所述的免疫效应细胞包括但不限于：t细胞、b细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞、nkt细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。

24、更进一步具体地，所述的免疫效应细胞为工程化免疫效应细胞。

25、优选地，所述的工程化免疫效应细胞包括但不限于：car-t细胞或car-nk细胞。

26、又一方面，本发明提供了一种药物，包括前述的嵌合抗原受体或前述的核酸或前述的慢病毒或前述的细胞。

27、具体地，所述的药物还包括药学上可接受的辅料。

28、优选地，所述的药学上可接受的辅料选自聚山梨酯、组氨酸、蔗糖、精氨酸、氯化钠、蛋氨酸、醋酸盐、海藻糖、脯氨酸、山梨醇、磷酸钠、泊洛沙姆188、乙二胺四乙酸、柠檬酸、甘露醇、谷氨酸盐、甘氨酸、柠檬酸钠、琥珀酸钠和/或乳酸。

29、具体地，所述的药物剂型包括但不限于：仅液体溶液、冻干粉、仅预充式注射器以及预充式注射器、冻干粉，片剂、胶囊剂、颗粒剂、喷雾剂。

30、具体地，所述的给药途径包括但不限于：眼内注射、静脉内注射、肌内注射、皮下注射、鼻吸入和口服。

31、又一方面，本发明提供了前述的嵌合抗原受体或前述的核酸或前述的慢病毒或前述的细胞在制备治疗肿瘤性疾病药物中的应用。

32、具体地，所述的药物还包括另外一种或多种抗肿瘤的药物。

33、具体地，所述的肿瘤可以是t细胞恶性肿瘤。

34、具体地，所述的t细胞恶性肿瘤包括但不限于：白血病，淋巴瘤。

35、又一方面，本发明提供了前述的嵌合抗原受体或前述的核酸或前述的慢病毒或前述的细胞在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。

36、本发明所取得的技术效果：

37、(1)5d-er可有效地阻断cd5在t细胞上的表达，防止靶向cd5 cart细胞的自杀现象；

38、(2)在不同效靶比的条件下，cd5 car-t细胞对ccrf-cem细胞都具有显著的特异性杀伤；

39、(3)5d.b car-t杀伤ccrf-cem细胞后ifn-γ分泌水平显著增加。