一种纤维素高产菌株筛选鉴定及菌株酶学性能测定方法

本发明属于微生物，涉及一种纤维素菌株筛选鉴定及菌株酶学性能测定方法，特别是涉及一种通过在布氏田鼠胃肠道内筛选出高酶活性纤维素菌株，并对菌株性能进行鉴定的方法。

背景技术：

1、纤维素是自然界中数量最多的可再生资源之一。由于其特殊的晶体结构在自然条件下难以被水解，仅少量纤维素能被降解利用。纤维素酶是一组能将纤维素分子降解为纤维二糖和葡萄糖等小分子物质的复合酶，是用于降解纤维素唯一有效的催化酶。利用微生物产纤维素酶降解纤维素是一种较有效的纤维素处理方法，该方法温和、产物产率高、无二次污染。

2、目前高纤维素酶生产成本、低酶活、不稳定等问题是制约纤维素资源利用的关键因素，降低纤维素酶的生产成本、提高酶活及稳定性是研究的重点。当前从土壤、堆肥、反刍动物胃肠道等环境中分离出高产纤维素酶野生菌株是其中的一种技术手段，对于纤维素酶的开发和工业应用非常重要。布氏田鼠是典型的盲肠发酵动物，其盲肠内微生物数量和种类复杂多样，但从布氏田鼠胃肠道内筛选高产纤维素菌株鲜有研究，也缺乏筛选和鉴定的方法。因此，如何从布氏田鼠胃肠道内筛选出高产纤维素菌株，进一步降低生产成本、满足工业化生产细菌纤维素的需求显得较为重要。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对目前缺乏从布氏田鼠胃肠道内筛选高产纤维素菌株筛选和鉴定的方法，提出一种纤维素高产菌株筛选鉴定及菌株酶学性能测定方法。

2、本技术提供的一种纤维素高产菌株筛选鉴定及菌株酶学性能测定方法采用如下技术方案：

3、一种纤维素高产菌株筛选鉴定方法，其特征在于，筛选鉴定方法包括以下步骤：

4、s1、随机选100日龄健康布氏田鼠雌雄各2只作为研究对象，饥饿12h后行安乐死，解剖取出盲肠，放入无菌ep管中，于-80℃冰箱中保存备用；

5、s2、在超净工作台上将盲肠内容物挤入50ml无菌生理盐水中，在摇床上震荡30min，摇完后菌液混匀，梯度稀释至10－5级，取各浓度稀释肠液0.2ml，分别涂布于cmc-na平板上，于37℃恒温培养箱中培养48h，向培养皿中加入适量的1mg·ml－1刚果红溶液，染色1h后弃去染液，再加入适量1mol·ml－1nacl液洗涤，并测量水解圈的大小；

6、s3、将初筛菌株接种到液体发酵产酶培养基中，培养24h后离心取上清液，即为粗酶液，以葡萄糖作为标准，采用3，5-二硝基水杨酸试剂法测定纤维素酶活性，cmc-na在纤维素酶的作用下，水解产生纤维二糖和葡萄糖等还原糖，还原糖能将dns中的硝基还原成棕红色氨基化合物，在波长600nm处测定吸光度d值，吸光度与酶活性呈正比；

7、s4、经初筛、复筛出1株纤维素酶活性最高的菌株t1，观察菌落的形态特征，并通过革兰染色观察菌体的染色特征；

8、s5、菌株t1培养过夜后用细菌基因组提取试剂盒提取dna，pcr反应的引物为细菌通用引物，pcr反应体系体积为25μl，测序，将测序结果在genbank数据库中用blast比对获得相似性高的序列，利用mega6.0构建系统进化树，根据菌株间的亲缘关系确定菌株的种属；

9、s6、将菌株t1接种到lb培养基中，培养至d600nm值为1.0，得种子液，按1％种子液接入50ml新配制的lb培养基中，37℃摇床培养，每4h用酶标仪测1次d600nm值，直至60h；

10、s7、将种子液接入发酵培养基中，依次优化培养基中碳源和氮源的种类、浓度和接种量，在37℃、160r·min－1振荡培养24h，将菌液在上述确定的最佳条件下进行纤维素酶活性测定，试验重复3次，结果取平均值。

11、通过上述技术方案，可以成功从布氏田鼠肠道内容物中筛选出纤维素活性最高的菌株t1，并可确定筛选出的t1菌株的最佳产纤维素酶量的条件。

12、进一步的，所述步骤s7中所述碳源的种类为高粱、玉米、大豆、羧甲基纤维素钠、水稻、小麦的一种或多种；氮源的种类为蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵、明胶中的一种或多种。

13、通过上述技术方案，所选取的碳氮源易被微生物吸收利用，性能稳定，且成本价格低，易获取。

14、进一步的，所述碳源和氮源的浓度分别为0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％。

15、通过上述技术方案，将碳氮源浓度设置在一个合理的范围可使菌株正常生长，而按照0.5％的梯度进行设置，有利于提升实验数据的精度和准确性。

16、进一步的，菌液的接种量分别为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％。

17、通过上述技术方案，菌液接种量过低会延长培养时间，接种量过高会影响产物的合成，并且会过多生成代谢废物，因此设置接种量在1％～7％区间，并且设置1％的增量梯度，可以精确获得影响酶活力的接种量。

18、一种纤维素菌株酶学性能测定方法，其特征在于，所述酶学性能测定方法包括：

19、(1)最适ph的测定：将1.0％ cmc-na的底物分别溶于ph3.0～7.0的缓冲液中，40℃反应30min后测定该纤维素酶活性，试验重复3次，结果取平均值，即可确定纤维素酶反应的最适ph值；

20、(2)酸碱稳定性的测定：将ph4.0～8.0缓冲液与粗酶液按同等量混匀，40℃水浴中保温1h，在最适ph反应条件下，测定相对纤维素酶活性，试验重复3次，结果取平均值，即可确定酶的酸碱稳定性；

21、(3)反应最适温度的测定：将粗酶液分别置于40-80℃中反应30min，测定该纤维素酶活性，试验重复3次，结果取平均值，即可确定纤维素酶反应的最适温度；

22、(4)热稳定性的测定：将粗酶液分别在30-70℃进行水浴，并保温1h，在最适温度和最适ph下测定相对酶活性，试验重复3次，结果取平均值，即可确定该酶的热稳定性；

23、(5)最适反应时间的测定：将粗酶液与cmc-na底物在最适ph及最适温度条件下分别反应10-50min，测定不同反应时间纤维素酶活性，即可确定纤维素酶反应的最佳时间。

24、通过采用上述技术方案，确定了该纤维素酶活性最适ph值、酸碱稳定性、反应最适温度、热稳定性和最适反应时间。

25、进一步的，所述反应最适温度的测定中粗酶液反应温度为40℃、50℃、60℃、70℃和80℃。

26、通过采用上述技术方案，温度过高或过低都会抑制其菌落形成和生长，影响纤维素降解效率，将反应温度设置在40～80摄氏度之间，并以10℃作为增量梯度，可以获得更为精准的反应温度；

27、进一步的，所述热稳定性的测定中粗酶液水浴温度为30℃、40℃、50℃、60℃和70℃。

28、通过采用上述技术方案，温度过低会使酶活性降低，温度过高会使酶失活，低于20℃或高于80℃时，酶会迅速失活，将水浴温度设置30℃～70℃区间，并以10℃作为增量梯度来进行实验，可获得更为精准的酶热稳定性的温度值。

29、进一步的，所述最适反应时间的测定中反应时间为10min、20min、30min、40min和50min。

30、通过采用上述技术方案，反应时间过短会导致反应不充分，反应时间过长会使代谢废物积累，将反应时间确定10～40min区间，并以10min作为增量梯度来进行实验，可以获得更为精准的纤维素酶反应的最佳时间。

31、综上所述，本发明包括以下至少一种有益技术效果：

32、1.本发明从布氏田鼠胃肠道内筛选出高产纤维素菌株，进一步降低了生产成本，可进一步满足工业化生产细菌纤维素的需求。

33、2.本发明利用微生物产纤维素酶降解纤维素，筛分鉴定方法简单，性能测定方法科学，产物产率高、无二次污染，为纤维素资源的开发利用提供参考，具有广泛的应用前景。

34、3.本发明结果丰富了布氏田鼠肠道源纤维素降解菌的种类，为高效菌株的纤维素酶利用提供了理论基础。