一种甲基化特异性单端锚定多重PCR扩增子文库的构建方法和试剂盒与流程

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种利用单端锚定多重pcr捕获检测低频甲基化突变的方法和试剂盒。

背景技术：

1、结直肠癌(colorectal cancer，crc)是一种常见的恶性肿瘤，全球每年结直肠癌新发病例数达193.16万。crc的发生和发展是一个多阶段、多因素的过程，涉及到多个基因的突变和表观遗传学改变。早期发现和治疗crc对于提高治愈率和生存率具有重要意义。然而，目前常规的crc筛查方法，如结肠镜和粪便隐血试验，存在侵入性大、依用性差等问题，无法满足大规模、频繁开展crc早期筛查的需求。因此，开发新型、高效、非侵入性的crc早期筛查方法成为迫切需求。

2、近年来，基于dna检测的crc早期筛查方法逐渐受到关注。dna是生物体遗传信息的载体，crc的发生和发展过程中会伴随着dna的改变。crc病变细胞中基因的突变和表观遗传学改变都会引起dna序列和表达水平的变化。通过检测这些dna序列的变化，可以实现对crc的早期筛查。其中，dna甲基化是一种重要的dna修饰方式，与crc的发生和发展密切相关。它是癌症发生的早期分子事件，贯穿于发展的全过程，是肿瘤液体活检的理想标志物。dna甲基化是指在dna甲基转移酶的作用下，在dna序列的5’-cpg-3’位点上添加一个甲基基团，从而调控基因表达和细胞分化。在crc中，一些基因的甲基化水平会发生变化，这些变化可以作为crc早期筛查的标志物。

3、因此，研究开发新的具有非侵入性、高灵敏度和特异性的甲基化特异性单端锚定多重pcr扩增子文库的构建方法和试剂盒对于提高crc早期筛查的效率和准确性以及提高crc患者的治愈率和生存率具有重要意义。

技术实现思路

1、为解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种甲基化特异性单端锚定多重pcr扩增子文库的构建方法和试剂盒，本发明构建的扩增子文库可用于早期结直肠癌的筛查。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供一种甲基化特异性单端锚定多重pcr扩增子文库的构建方法，包括以下步骤：

4、(1)提取血浆游离dna样本，通过末端修复、末端加a，连接短y接头后纯化；

5、(2)将步骤(1)得到的产物经重亚硫酸盐处理，纯化回收；

6、(3)根据所选的目标基因区域设计相应的甲基化特异性单端锚定pcr引物，对步骤(2)得到的产物进行甲基化特异性单端锚定多重pcr捕获；

7、(4)将步骤(3)得到的产物进行第二轮pcr扩增富集，即得甲基化特异性单端锚定多重pcr扩增子文库。

8、进一步地，步骤(1)中所述的血浆游离dna通过circulating nucleicacid kit试剂盒提取获得；所述的末端修复、末端加“a”通过end repair&a-tailingenzyme mix反应体系完成。

9、进一步地，步骤(1)中所述的短y接头包括具有部分互补的上游引物f和下游引物r，所述的上游引物f包含短y接头互补序列，核苷酸序列如seq id no.1所示；所述的下游引物r包含通用序列1、分子标签(加粗加下划线的碱基)和短y接头互补序列，核苷酸序列为其中所述分子标签为8～16bp的长度，为由a、t、c、g的任意排列组合而成，但是不出现连续四个相同碱基，上游引物f和下游引物r序列中所有的c碱基经过甲基化修饰。

10、进一步地，步骤(2)中所述的重亚硫酸盐处理通过qiagen epitect fastbisulfite kit试剂盒完成。

11、进一步地，步骤(3)中所述的目标基因区域包括结直肠癌早筛强相关的抑癌基因启动子区域。

12、进一步地，步骤(3)中所述的甲基化特异性单端锚定pcr引物包括上游捕获引物和下游捕获引物；上游捕获引物包括上游通用序列2和上游特异性引物，核苷酸序列如seq idno.4-13所示；下游捕获引物为通用引物，核苷酸序列如seq id no.3所示。

13、进一步地，步骤(4)中所述pcr扩增富集过程使用富集引物进行，富集引物包括上游富集引物和下游富集引物；上游富集引物包括p5端接头序列、indexd序列和通用序列2；下游富集引物包括p7端接头序列、indexn序列和通用序列1。

14、进一步地，上述接头序列可以为任意常用的接头序列或者为新开发的接头序列，接头序列可随测序平台的不同而不同，只要满足能够进行目标测序平台的测序即可。另外，接头序列还包括长度为8bp的index序列，作用在于区分不同的dna样本，对于index序列的碱基组成没有特殊限制，可以保证将不同的dna样品区分开来即可，即：用于构建同一个dna样品的扩增子文库的引物组中，上游通用引物中的index序列不同。可选地，上述接头序列包含p5和p7接头的部分序列。

15、进一步地，步骤(4)中所述的上游富集引物的核苷酸序列如seq id no.14-22所示，所述的下游富集引物的核苷酸序列如seq id no.23-34所示。

16、本发明另一方面提供一种适用于血液筛查甲基化突变的检测方法，将上述构建方法获得的甲基化特异性单端锚定多重pcr扩增子文库通过illumina测序平台进行测序，通过生物信息学对得到实验数据进行分析和比对，获得目标区域内甲基化率。

17、进一步地，所述的illumina测序平台包括illmina nextseq 500、illuminahiseq2000、illumina hiseq2500和illumina novaseq；测序策略为pe150。

18、本发明另一方面提供一种用于甲基化特异性单端锚定多重pcr扩增子文库构建的试剂盒，试剂盒包括以下成分：游离dna提取的试剂，末端修复、加“a”及连接短y接头所需要的酶、缓冲液，重亚硫酸盐处理及纯化回收试剂，甲基化特异性单端锚定多重pcr捕获的引物及试剂和文库扩增富集的引物及试剂。

19、进一步地，所述的短y接头包括具有部分互补的上游引物f和下游引物r，所述的上游引物f包含短y接头互补序列，核苷酸序列如seq id no.1所示；所述的下游引物r包含通用序列1、分子标签(加粗加下划线的碱基)和短y接头互补序列，核苷酸序列为其中所述分子标签为8～16bp的长度，为由a、t、c、g的任意排列组合而成，但是不出现连续四个相同碱基，上游引物f和下游引物r序列中所有的c碱基经过甲基化修饰。

20、进一步地，甲基化特异性单端锚定多重pcr捕获的引物包括上游捕获引物和下游捕获引物；上游捕获引物包括上游通用序列2和上游特异性引物，核苷酸序列如seq idno.4-13；下游捕获引物为通用引物，核苷酸序列如seq id no.3所示。

21、进一步地，文库扩增富集的引物包括上游富集引物和下游富集引物；上游富集引物包括p5端接头序列、indexd序列和通用序列2；下游富集引物包括p7端接头序列、indexn序列和通用序列1。

22、进一步地，上游富集引物的核苷酸序列如seq id no.14-22所示，所述的下游富集引物的核苷酸序列如seq id no.23-34所示。

23、本发明还提供上述的试剂盒在结直肠癌早期筛查中的应用。

24、本发明的有益效果：

25、本发明提供一种甲基化特异性单端锚定多重pcr扩增子文库的构建方法以及非侵入性、高灵敏度和特异性的crc甲基化检测方法，本发明能够准确、快速地检测crc甲基化突变，提高crc早期筛查的效率和准确性。通过单端锚定高通量测序技术可以实现对crc病变的基因突变进行检测，进一步揭示crc的遗传学特征和发生机制。单端锚定多重pcr建库是通过设计分子标签，区分上游和下游扩增序列，进而判断出真突变和假突变，单端序列的延伸也提高了模板利用率，能够实现对crc病变基因的高灵敏度和高分辨率检测。将dna甲基化后使用单端锚定多重pcr建库技术应用于crc早期筛查，具有非侵入性、高灵敏度和特异性的优点。通过检测crc病变细胞的基因突变和甲基化水平，可以揭示crc的发生和发展。同时，利用单端锚定多重pcr建库技术对crc病变的基因序列进行基因组测序，可以发现新的crc相关基因突变和表观遗传学改变，进一步丰富crc早期筛查标志物的种类和数量。对于提高crc患者的治愈率和生存率具有重要意义，有助于推动crc早期筛查在临床实践中的应用和发展。