FCGR2A基因检测引物探针组合、试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及基因检测领域，尤其涉及一种fcgr2a基因检测引物探针组合、试剂盒以及应用。

背景技术：

1、川崎病（kawasaki disease，kd）又可称之为皮肤黏膜淋巴结综合征，常发生于5岁以下的儿童。川崎病病因不明，目前认为是由遗传因素、感染和免疫的复杂相互作用的结果，可并发冠状动脉病变（coronary artery lesions，cal），川崎病导致的cal是现阶段导致发达国家儿童罹患后天性心脏病的主要病因[1]。根据相关研究报道显示，在川崎病发病的早期阶段，若未采取积极有效的干预方式，15%-25%的患儿均会同时并发冠状动脉扩张，引发冠状动脉瘤[2]。

2、川崎病的诊断依据通常是具有发热症状，以及具有以下至少4项临床表现：双侧球结膜充血、口唇干红，草莓舌，口腔部粘膜弥漫性充血、皮疹、急性期手足发红、肿胀，恢复期甲周脱皮、非化脓性颈部淋巴肿大。但是有些患儿的临床表现少于4项，即不完全川崎病。这类患儿的诊断比较困难，很容易贻误治疗时期，从而引发cal。因此对川崎病并发cal相关基因的检测有助于对川崎病并发cal的预后和风险评估。

3、目前的研究报道了多个川崎病并发cal的相关基因，提示预后和风险评估。其中fcgr2a（fc fragment of igg receptor iia）编码igg受体家族中的fcγrⅱa。该基因编码的蛋白质是一种在巨噬细胞和中性粒细胞等吞噬细胞上发现的细胞表面受体，参与吞噬和清除免疫复合物的过程，与自身免疫和感染性疾病相关。研究表明fcgr2a是kd的易感基因，其中fcgr2a（rs1801274）等位基因a发生ad的风险更高，且进一步研究发现基因型aa使kd并发cal的风险更大[3-5]。

4、人基因组中的fcgr2a基因的snp位点rs1801274属于单核苷酸位点的多态性。单核苷酸多态性（snp）全称single nucleotide polymorphisms，是指在基因组等位基因上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。常用snp分析方法有pcr-测序法、sanger测序法、高通量测序技术、pcr-芯片杂交法、突变扩增系统（amplification refractory mutation system，arms）等。这些分析方法中，直接测序的方法时间周期较长，不能及时为医生提供指导；芯片法成本高，使应用受到一定限制。

5、鉴于此，特提出本发明。

6、参考文献：

7、[1] 中华医学会儿科学分会心血管学组, 中华医学会儿科学分会风湿学组, 中华医学会儿科学分会免疫学组, 等. 川崎病诊断和急性期治疗专家共识. 中华儿科杂志,2022, 60(1):6-13.

8、[2] shuman s t, rowley a h. kawasaki disease：insightsintopathogenesis and approaches to treatment [j]. nat rev rheumatol, 2015,11(8)：475-482.

9、[3] duan et al. a genetic variant rs1801274 in fcgr2a as a potentialriskmarker for kawasaki disease: a case-control study and meta-analysis. plosone, 2014;9(8):e103329.

10、[4] 纪玉晓 等.川崎病患儿fcgr2a基因单核苷酸多态性的研究.中国当代儿科杂志,2013,15(03):196-200.

11、[5] yan et al. combined analysis of genome-wide-linked susceptibilitylocito kawasaki disease in han chinese. hum genet 132, 669-680, 2013。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种fcgr2a基因检测引物探针组合、试剂盒以及应用。

2、目前市场上还没有有关人fcgr2a基因多态性检测试剂盒，本产品基于实时荧光pcr技术，采用扩增阻碍突变系统（amplification refractory mutation system，arms），实现口腔脱落细胞样本或全血样本中fcgr2a基因的snp位点rs1801274的分型。

3、本发明针对fcgr2a基因rs1801274位点设计特异性位点检测引物。对于fcgr2a基因a位点，pcr扩增时，由于fcgr2a基因aa引物3'末端的碱基与fcgr2a基因a位点的模板完全配对，引物延伸并对fcgr2a基因a位点的模板进行扩增，而与fcgr2a基因g位点的模板由于不能完全配对，引物的延伸被阻断，fcgr2a基因g位点的模板扩增被抑制，对于fcgr2a基因g位点的扩增反之。从而实现fcgr2a基因的分型。

4、并且fcgr2a基因的探针为cy5荧光标记，内源性内标基因（人类管家基因）为vic荧光标记，通过不同的荧光标记可实现在同一管中进行3重反应。通过内标可以对待测样本的采集、核酸提取、pcr检测全过程实行监控。另外，本产品添加了防污染组分ung酶，其作用机理是选择性水解断裂含有du的双链或者单链dna中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的dna链，在碱性介质以及高温下会进一步水解断裂，从而被消除。

5、本发明的目的通过下述技术方案实现：

6、本发明的第一方面提供一种引物探针组合，所述引物包括：选自核苷酸序列如seqid no：1所示的上游引物，核苷酸序列如seqid no：2所示的下游引物，用于检测fcgr2a基因rs1801274位点的a位点；选自核苷酸序列如seq id no：4所示的上游引物，核苷酸序列如seq id no：5所示的下游引物，用于检测fcgr2a基因rs1801274位点的g位点；

7、所述探针包括seq id no：3和seq id no：6所示的检测探针；seq id no：3用于检测fcgr2a基因rs1801274位点的a位点；seq id no：6用于检测fcgr2a基因rs1801274位点的g位点。

8、在一些实施方式中，所述引物还包括内参引物，所述探针还包括内参探针。

9、在一些实施方式中，所述内参引物和所述内参探针用于定量检测人管家基因的核酸片段的表达。

10、在一些实施方式中，所述内参引物的上游引物、下游引物的核苷酸序列依次如seqid no：7和seq id no：8所示；所述内参探针的核苷酸序列如seq id no：9所示。

11、另外，需要说明的是，在一个方面，有用的引物和探针包括与seq id no：1～9所示的引物或探针具有大于60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列。还考虑了这样的引物和探针修饰并且可根据标准技术制备。

12、引物和探针修饰可以采用公知的方法。这些引物和/或探针序列的修饰版本可包括，通过非限制性例子，将一个或多个核苷酸添加到5’端，将一个或多个核苷酸添加到3’端，将一个或多个核苷酸添加到5’端和3’端，添加尾部，缩短序列，延长序列，将序列上下游移动几个碱基，或其任何组合。

13、碱基修饰例如3'p、5'p、5-硝基吲哚、2-氨基嘌呤、8-氨基-2'-脱氧腺苷、c-5丙炔基-脱氧胞苷、c-5丙炔基-脱氧尿苷、2-氨基-2'-脱氧腺苷-5'-三磷酸、2,6-二氨基嘌呤(2-氨基-da)、反向dt、反向二脱氧-t、羟甲基dc、异-dc、5-甲基dc、氨基乙基-吩噁嗪-脱氧胞苷，和锁核酸(lna’s)，并包括在碱基之一处的至少一个错配碱基，或者替换其中至少一个碱基为rna碱基，以实现例如增加突变体特异性引物3’端的核酸相互作用，以增加tm。双链稳定碱基修饰的加入对pcr有积极的影响，从而使其能够在较高的温度下进行，在此范围内已知taq聚合酶显示出最大的活性。修饰后的探针应当保留区分待检测突变位点和野生型位点的能力。

14、如本说明书使用的术语“探针”是指可指示扩增的多种信号传导分子中的任意一种。例如，sybr green和其他dna结合染料是检测探针。可以是基于序列的检测探针，例如5’核酸酶探针。一些检测探针是本领域已知的，例如taqman探针、茎环分子信标、mgb探针、scorpiontm探针、锁核酸(lna)探针、肽核酸（pna）探针等。

15、在一些实施方式中，所述探针为自身淬灭探针。

16、在一些实施方式中，各探针的荧光发射基团独立地选自amca、pacific blue、atto425、bodipyfl、fam、alexa fluor 488、tet、joe、yakima yellow、vic、hex、quasar 570、cy3、ned、tamra、rox、aqua phluor593、texasred、atto 590、cy5、quasar 670以及cy5.5中的任一种。

17、在一些实施方式中，所述内参探针与所述检测探针的荧光发射基团信号可区分。

18、本发明可同时采用多通道进行，只需在不同通道采用单独的探针即可。在一些优选的实施方式中，检测探针和内参探针上的荧光发射基团在同一反应体系下可被区分。

19、在一个具体的实施例中，seq id no：3、6所示的探针上的荧光发射基团均为cy5；seq id no：9所示的探针上的荧光发射基团为vic。

20、在一些实施方式中，各探针的淬灭基团独立地选自bhq1、bhq2、bhq3、dabcyl、eclipse以及mgb中的任一种，优选bhq3或bhq1。

21、本发明的第二方面提供含有上述引物探针组合的试剂盒。

22、术语“试剂盒”是指包括至少一个设备的任何制品（例如，包装或容器），试剂盒可进一步包括在本文中描述的方法或其步骤中使用的使用说明书、补充试剂和/或组分或组件。

23、在一些实施方式中，所述的试剂盒还包含扩增缓冲液、dntp、mg2+、ung 酶、dna聚合酶、阳性质控品、阴性质控品、防腐剂以及水中的至少一种。

24、适合于实施本发明的聚合酶是本领域熟知的，可以从多个来源获得。热稳定性dna聚合酶可以从多种商业途径获得，使用本领域技术人员熟知的方法。优选的热稳定性的dna聚合酶可以包括但不限于：taqdna聚合酶或其突变体、衍生物或片段。

25、优选的，试剂盒中的核酸组分，例如引物、探针、阳性对照以及阴性对照以干粉形式存放于试剂盒中。阳性对照以及阴性对照也可以以质粒的方式存在。

26、各组分优选以冻干形式，例如以一种或多种所谓的冻干珠的形式实现。冻干珠通常可以被理解为是指在制造后（在所述制造后物质通常作为粉末存在）被压制成球形的冻干物。因此，可以例如以冻干形式提供pcr批次所需的组分，特别是dna聚合酶、核酸组分以及反应缓冲剂组分。以这种方式，可以通过添加待定量的样品以及任选其它所需组分以对于用户非常友好的方式直接开始pcr过程。特别地，冻干形式的提供非常有利于自动化应用。

27、本发明的第三方面提供上述引物探针组合制备fcgr2a基因的snp位点rs1801274分型的试剂盒中的应用。

28、本发明所公开的组合产品和/或试剂盒中的核酸样品的来源包括但不限于，细胞，例如循环血液、培养的细胞、肿瘤细胞。样本的来源例如咽拭子、鼻拭子、痰液、呼吸道吸取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、眼结膜拭子、唾液样品、粪便标本、抗凝血和血清标本中的一种或多种。dna可以是基因组或者质粒或其他载体中的dna。本发明用于检测基因组dna中的突变，可以是灵长类动物（尤其是人）以及公知或未知的具有fcgr2a基因rs1801274位点（a>g）突变的其他任何动物或其他。在一些实施方式中，模板序列或核酸样品可以是gdna。在一些实施方式中，模板序列或核酸样品可以是口腔脱落细胞样本dna或全血样本dna。dna模板序列或核酸样品可以是任意类型的组织，包括例如福尔马林固定的石蜡包埋组织样品。模板核酸还可以是使用本领域已知的技术化学合成的。

29、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

30、本发明使用arms结合荧光pcr技术具有高特异性以及高灵敏性，检测时耗短，成本低，结果直观好判读。