基于CRISPR技术的一体化梅毒核酸扩增检测卡盒及其操作方法

本发明涉及核酸检测卡盒，具体涉及基于crispr技术的一体化梅毒核酸扩增检测卡盒及其操作方法。

背景技术：

1、梅毒(syphilis)是一种由梅毒螺旋体(苍白螺旋体,treponema pallidum,tp)引起的能侵犯人体几乎所有组织器官的慢性、系统性性传播传染病。近年来，梅毒发病率逐年升高，据who估计全球每年新增梅毒感染高达630万例。由于梅毒螺旋体体外困难，当前梅毒诊断主要依赖血清学检测方法，包括非螺旋体抗原和梅毒螺旋体特异性抗原检测。血清学检测的主要局限在于非梅毒螺旋体抗原检测敏感度和特异性不足，而梅毒螺旋体特异性抗原检测呈阳性可能会终生持续，因而无法区分既往感染和进行中的感染，也无法区分治疗和未治疗状态。病原学方法直接检测梅毒螺旋体可以在某些方面克服这些局限，目前已经发展得较成熟的主要包括暗视野镜检、直接荧光抗体检测、银染或免疫组织化学手段以及核酸扩增检测。但这些直接方法各自也存在相应的不足，例如，暗视野镜检要求在20分钟内快速送达检测以保证梅毒螺旋体的活性。核酸扩增检测方法灵敏度和特异性较高，但极为依赖专业操作人员及专门仪器设施。由于梅毒这类性传播疾病私密性较强，相当一部分感染者并不愿前往专业实验室检测。如何在非实验室场景下实现梅毒的有效准确诊断进而采取相应措施阻断感染尤为关键。

2、现有等温扩增核酸检测技术包括环介导等温扩增(lamp)、重组聚合酶扩增(rpa)、核酸序列依赖性扩增(nasba)等可以无需pcr热循环进行目标序列的高效复制，在核酸扩增环节可以避免复杂专用仪器的使用。但由于等温扩增反应易产生特异性扩增并且产物特异性检测较为困难，这些不足也在很大程度限制了广泛应用。新兴的crispr分子诊断利用crispr-cas效应蛋白在靶标与crrna互补配对条件的激发下产生协同切割活性进行信号放大，可以发挥“特异性识别+信号放大”的作用，而且crispr-cas反应与等温扩增的反应温度兼容，因此可以与等温扩增联用对扩增产物进行特异性识别和检测信号的进一步增强检测。基于此，一系列此类方法及其技术迭代包括sherlock、detectr被陆续开发出来。例如，在杜德娜等人开发的detectr技术中，利用crispr-cas12体系直接对rpa等温扩增产物dna进行识别和检测，取得极高的检测灵敏度和特异性。值得注意地是，在这些技术中，最终检测性能很大程度上取决于预扩增环节的效能。为此，大多数这类技术及其迭代往往将预扩增环节与crispr-cas检测进行分离或分隔，以避免在扩增初期crispr-cas对靶标的竞争性消耗。但是，预扩增与crispr-cas检测的分离或分隔意味着需要在预扩增结束后将扩增产物与crispr-cas体系汇合以启动cas检测反应。

3、如何避免两步衔接过程中可能因扩增产物环境暴露而产生气溶胶污染以及手动操作所产生的不便和可能引入的偏差，对于更好地发挥这类技术优势实现非实验室场景下的可靠检测无疑是当前迫切需要解决的问题。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是：提供一种基于crispr技术的一体化梅毒核酸扩增检测卡盒及其操作方法，能够将预扩增环节与crispr-cas检测衔接避免污染，同时易于非实验室场景操作。

2、为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、基于crispr技术的一体化梅毒核酸扩增检测卡盒，包括通过连接通道依次相连的检测驱动气腔、crispr试剂存储腔、检测液存储腔、第一汇合腔，还包括通过连接通道依次相连的扩增驱动气腔、扩增试剂存储腔、上样启动腔、第二汇合腔，还包括通过连接通道依次相连的混合通道、预反应腔、主反应腔、流阻通道、排气腔，第一汇合腔和第二汇合腔均通过连接通道接入混合通道；连通外界的排气腔内装有空气滤芯。

4、作为一种优选，检测驱动气腔和crispr试剂存储腔之间连接通道、检测液存储腔和第一汇合腔之间连接通道、扩增驱动气腔和扩增试剂存储腔之间连接通道、上样启动腔和第二汇合腔之间连接通道、预反应腔和主反应腔之间连接通道均为顶部连接通道；crispr试剂存储腔和检测液存储腔之间连接通道、扩增试剂存储腔和上样启动腔之间连接通道、第一汇合腔和混合通道之间连接通道、第二汇合腔和混合通道之间连接通道均为底部连接通道。

5、作为一种优选，基于crispr技术的一体化梅毒核酸扩增检测卡盒，包括从上往下依次设置的顶层、中间层、底层；底层为平板结构；底部连接通道、混合通道、流阻通道、多个通孔均设置在中间层；顶部连接通道、多个凹陷区域、排气口设置在顶层；一个通孔与排气口正对围成排气腔，空气滤芯设置在排气口内；其余通孔与凹陷区域一一正对，分别围成检测驱动气腔、crispr试剂存储腔、检测液存储腔、第一汇合腔、扩增驱动气腔、扩增试剂存储腔、上样启动腔、第二汇合腔、预反应腔、主反应腔。

6、作为一种优选，顶层的上端粘贴覆盖排气口的、可撕除的密封膜。

7、作为一种优选，检测驱动气腔和扩增驱动气腔内容纳空气，空气受热膨胀作为物料移动的驱动力；crispr试剂存储腔内预装crispr试剂，检测液存储腔内预装检测液，扩增试剂存储腔内预装扩增试剂，待测样品添加至上样启动腔，第一汇合腔用于crispr试剂和检测液的预混合得到crispr检测试剂，第二汇合腔用于预扩增反应得到扩增产物，混合通道用于crispr检测试剂和扩增产物的混合，预反应腔和主反应腔用于crispr-cas反应和信号给出。

8、作为一种优选，卡盒置于加热装置上；加热装置用于检测驱动气腔和扩增驱动气腔内空气的加热膨胀，提供物料移动的驱动力；加热装置还用于提供预扩增反应和crispr-cas反应的温度。

9、作为一种优选，混合通道和流阻通道均为螺旋形通道。

10、基于crispr技术的一体化梅毒核酸扩增检测卡盒的操作方法，包括如下步骤：(1)将样品置入上样启动腔，除排气腔外，其余腔体密封；(2)将卡盒放置在加热装置上；(3)加热装置升温至温度t1，并维持时间t1；在此过程中，位于扩增试剂存储腔的扩增试剂在热膨胀的空气驱动下依次进入上样启动腔和第二汇合腔，并在第二汇合腔发生样品靶标的预扩增反应；同时地，位于crispr试剂存储腔的crispr试剂在热膨胀的空气驱动下依次进入检测液存储腔和第一汇合腔，并在第一汇合腔进行crispr检测试剂的预混合；(4)加热装置升温至温度t2，并维持时间t2；位于第一汇合腔的crispr检测试剂与位于第二汇合腔的扩增产物同步被检测驱动气腔和扩增驱动气腔膨胀的空气依次推送至混合通道、预反应腔和主反应腔，完成扩增产物与crispr-cas检测体系的混合、反应及信号给出。

11、作为一种优选，步骤(4)中，或选择持续监测主反应腔的信号强度变化，或在反应终点观测最终信号状态，从而判别样品中目标核酸的存在与否及相对含量的多少。

12、作为一种优选，crispr试剂包括crispr-cas蛋白、crrna、缓冲液；检测液包括报告探针及缓冲液；步骤(3)中，温度t1为37℃，时间t1为15-30分钟；步骤(4)中，温度t2为42-45℃，时间t2为5-30分钟。

13、本发明具有如下优点：

14、1.将预扩增环节与crispr-cas检测衔接，并可避免污染。

15、2.易于非实验室场景操作，保护私密性。

16、3.采用空气滤芯，避免试剂外溢。

17、4.操作方便，仅通过控制温度，即可控制物料的移动和反应。

18、5.解决了现有梅毒核酸检测依赖专用仪器设备和专业人员操作及存在扩增产物污染风险。