一种麦芽香肉杆菌选择性培养基及其制备和应用

本发明属于动物源性食品微生物的生物学检验领域，具体涉及一种麦芽香肉杆菌选择性培养基及其制备和应用。

背景技术：

1、肉杆菌是一类广泛存在于不同动物源性食品中的非典型性乳酸菌，其中广布肉杆菌(carnobacterium divergens)和麦芽香肉杆菌(carnobacterium maltaromaticum)是肉中最常见的两个菌种，与肉制品货架期息息相关。目前已有研究证明肉杆菌可以广泛存在于有氧包装、真空包装及气调包装的肉制品中，相对于有氧包装贮藏环境，肉杆菌在无氧环境下会展现出更好的生长优势。对于长期低温储藏的真空包装肉类，肉杆菌被视为一种潜在的优势腐败菌。但同时有研究发现某些麦芽香肉杆菌产生的代谢产物对肉类腐败的影响可以忽略不计。该菌还具备分泌细菌素、有机酸等抑菌物质的能力，可以应用于鱼类、牛肉、火腿、奶酪等多种动物源性食品的货架期延长等方面。因此，以麦芽香肉杆菌为代表的肉杆菌正成为开发新型生物保护剂的热点研究方向，在肉类保鲜领域具有巨大的应用潜力。

2、目前，针对肉杆菌的分离检测步骤主要是依靠将待测菌液在胰蛋白胨大豆琼脂(tryptone soya agar，tsa)培养基或apt(all purpose tween 80)琼脂培养基等非选择性培养基上进行培养，随后再进行划线纯化，待分离出单个疑似菌落后，再对其进行革兰氏染色、生理生化鉴定，随后通过16s rdna序列测序并构建系统发育树，进而确定分离菌株种类。但上述培养基主要用于大部分细菌，或异质发酵乳酸杆菌和其他需要高含量盐酸硫酸胺素菌的培养，对麦芽香肉杆菌并没有特异性的选择，需要在大范围的疑似菌落中逐一进行麦芽香肉杆菌的分离鉴定，工作难度大且分离效率低。

3、由于麦芽香肉杆菌为革兰氏阳性菌，兼性厌氧，无芽孢，过氧化氢酶检测为阴性且缺少运动性，以上特征与乳酸菌的鉴定特征一致，这增加了该菌与其他乳酸菌的区分难度。另外，对麦芽香肉杆菌的生理生化鉴定主要是通过其利用葡萄糖、果糖、麦芽糖、核糖、水杨苷、纤维二糖、甘露糖产酸的代谢特征来实现，使用传统生理生化鉴定方法从疑似菌落中逐一筛选麦芽香肉杆菌，其步骤非常繁琐，且麦芽香肉杆菌的上述生理生化鉴定结果与弯曲乳杆菌、清酒乳杆菌等乳杆菌的生理生化鉴定结果相同，这使得明确目标菌株是否为麦芽香肉杆菌变得更加困难。以上原因综合导致了麦芽香肉杆菌的检出率十分低下。因此，目前尚缺乏有效的分离手段来实现对麦芽香肉杆菌的精确筛选，针对该菌选择性培养基的开发更是难度极大。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种麦芽香肉杆菌的选择性培养基及其制备和使用方法。该选择性培养基可以用于麦芽香肉杆菌的高效分离培养与计数，同时可有效抑制动物源性食品中主要优势微生物(热杀环丝菌、荧光假单胞菌、莓实假单胞菌、弯曲乳杆菌、清酒乳杆菌等)的生长。

2、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

3、本发明第一方面，提供了一种麦芽香肉杆菌选择性培养基，包括以下原料：

4、蛋白胨：8-12g/l、蔗糖：8-12g/l、吐温-80：0.8-1.2g/l、盐酸硫胺素：0.001-0.002g/l、乳酸链球菌素：0.001-0.002g/l、甲酚红：0.003-0.005g/l、氯化三苯基四氮唑：0.005-0.015g/l、酵母提取物：8-12g/l、菊粉：10-20g/l、硫酸锰：8-12g/l、万古霉素：0.001-0.003g/l、萘啶酸：0.05-0.07g/l、硫酸粘菌素：0.03-0.05g/l、琼脂粉：12-18g/l、柠檬酸钠：4-6g/l、磷酸氢二钾：1-3g/l。

5、优选的，所述麦芽香肉杆菌选择性培养基包括以下原料：

6、蛋白胨：10g/l、蔗糖：10g/l、吐温-80：1g/l、盐酸硫胺素：0.001g/l、乳酸链球菌素：0.00125g/l、甲酚红：0.004g/l、氯化三苯基四氮唑：0.01g/l、酵母提取物：10g/l、菊粉：15g/l、硫酸锰：10g/l、万古霉素：0.001-0.003g/l、萘啶酸：0.05-0.07g/l、硫酸粘菌素：0.03-0.05g/l、琼脂粉：15g/l、柠檬酸钠：5g/l、磷酸氢二钾：2g/l。

7、本发明第二方面，提供了上述麦芽香肉杆菌选择性培养基的制备方法，包括如下步骤：

8、(1)称取蛋白胨、蔗糖、吐温-80、甲酚红、酵母提取物、柠檬酸钠、磷酸氢二钾，溶解于蒸馏水中，混匀备用，得到基础营养液；

9、(2)称取盐酸硫胺素、乳酸链球菌素、菊粉、硫酸锰、万古霉素、萘啶酸、硫酸粘菌素加入到基础营养液中，煮沸冷却，将ph调节至9.0备用；

10、(3)向步骤(2)得到的溶液中加入琼脂粉，定容后高压蒸汽灭菌，加入经过滤除菌处理的氯化三苯基四氮唑，冷凝后得到麦芽香肉杆菌选择性培养基。

11、优选的，上述步骤(2)中，所述ph调节使用1mol/l的naoh溶液。

12、优选的，上述步骤(3)中，将氯化三苯基四氮唑配制成1％溶液，使用0.22um微孔滤膜过滤除菌，然后将其加入到灭菌后采用55℃水浴保温的培养基中，使其终浓度为0.01g/l。

13、本发明是将氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride，ttc)和培养基中的其他组分分开进行灭菌处理，然后将ttc溶液直接加入经灭菌的培养基中，即在无菌超净工作台倒平板前将无菌的ttc溶液直接加入培养基中摇匀使用。若将ttc溶液加入培养基后一起高压蒸汽灭菌，会使培养基颜色加深，不利于显色和计数。因此先将培养基中的其他组分进行定容后再进行高压蒸汽灭菌，之后再加入除菌的ttc溶液，上述操作有利于该选择性培养基的显色和计数。

14、本发明第三方面，提供了上述麦芽香肉杆菌选择性培养基在麦芽香肉杆菌培养、分离和/或计数中的应用。

15、本发明第四方面，提供了一种对麦芽香肉杆菌进行选择性培养的方法，包括如下步骤：将待检测菌液样品均匀涂布至上述麦芽香肉杆菌选择性培养基中，25℃培养96h，即可选择性培养得到麦芽香肉杆菌。

16、本发明的有益效果：

17、(1)本发明设计了一种检出率高、稳定性好、选择性强的麦芽香肉杆菌选择性培养基，填补了目前尚无培养基可实现麦芽香肉杆菌特异性筛选的技术空白，为后续深入研究麦芽香肉杆菌的生理生化活动以及开发生物保护剂奠定了基础。

18、(2)基于本发明设计的麦芽香肉杆菌选择性培养基，本发明还提供了一种在动物源性食品中有效分离麦芽香肉杆菌的方法。本发明的麦芽香肉杆菌选择性培养基中，添加萘啶酸可以有效抑制大肠杆菌、变形杆菌等大部分革兰氏阴性菌的生长；万古霉素可以抑制肠球菌的生长；乳酸链球菌素用来抑制乳杆菌、明串珠菌、李斯特菌等微生物的生长，尤其可抑制产芽孢革兰氏阳性菌的生长；培养基的ph范围设定在9.0，此条件可以抑制大多数杂菌(包括乳酸菌)的生长，并促进麦芽香肉杆菌的生长。高ph条件结合以上抗生素的使用为选择性分离麦芽香肉杆菌提供了保障，提高了麦芽香肉杆菌的分离率。