一类硝基还原酶半菁染料荧光探针的制备和检测方法及其在临床细菌鉴定中的可视化应用

本发明属于生物医学和分析化学的交叉领域，具体涉及一类硝基还原酶开启式半菁染料荧光探针及其制备方法、检测方法，以及该探针在临床细菌鉴定中的可视化应用。

背景技术：

1、细菌作为微生物的典型代表，对人们的生产生活和生命健康密切相关。大多数细菌对人类无害，在消化道、维生素生产和病变细胞的清除等方面发挥着重要作用。但在临床上，致病菌可能会导致严重的健康问题，如肺炎、腹泻、骨髓炎和双重感染甚至死亡。例如，世界卫生组织在2017年报告的处于“优先状态”的危害病原体eskape家族(粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌属细菌)，其对多种抗生素发展出了耐药机制，在医院获得性感染中此类细菌的占比逐渐增加，正成为世界范围内的一个严重问题。由于缺乏快速诊断方法来识别临床环境中的细菌病原体，导致在治疗过程中经常不必要地使用广谱抗生素。因此细菌菌株的鉴定对于细菌感染的治疗和抗生素的开发至关重要。

2、当前，临床上和生物实验室中用于鉴定细菌的方法主要有核酸扩增、蛋白/酶鉴定、基因组测序等。此外，微流控平台和许多改进的质谱分析法也正在被研究人员开发中。然而，这些方法往往都需要昂贵的仪器和复杂耗时的程序。为了克服这些局限性，研究人员转而致力于使用具有非侵入性、高灵敏度和高特异性等特性的荧光探针或纳米材料用于细菌的检测和鉴定，这使得细菌在体外和体内的实时成像和定量分析成为可能。目前，基于硝基还原酶开发细菌荧光探针被认为是一个明智之举。硝基还原酶(ntr)是一类主要存在于细菌以及古生菌和真核生物中的黄素酶家族，能以β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)或β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)为辅因子，催化硝基芳香族化合物还原成相应的胺类化合物。硝基还原酶在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中广泛表达，因此其活性可以作为检测病原性微生物污染的通用指标。

3、尽管很多硝基还原酶响应型荧光探针具有很高的灵敏度，但它们缺乏简便直观区分细菌种类的能力，这对临床上的细菌诊断和治疗具有重要意义。在这里，我们基于半菁染料结构设计并合成了硝基还原酶“开启式”荧光探针，并进一步尝试将其应用于细菌的检测和鉴定。在表观颜色上，探针对eskape家族的不同致病菌呈现出明显的差异性，并在细菌荧光成像方面也具有较大的应用潜力。据我们所知，虽然有一些纳米材料实现了某些细菌的比色鉴别，但这些工作通常聚焦于单一或者几个菌种，且纳米材料在制备和应用上并不如小分子荧光探针简便和快速。因此我们这是首次报道了使用小分子荧光探针实现了eskape家族致病菌的可视化鉴定。

技术实现思路

1、发明目的：为了克服现有检测技术的不足，本发明提供了一类硝基还原酶开启式半菁染料荧光探针的制备方法及其在可视化鉴定临床细菌中的应用。该类半菁染料荧光探针制备简便、响应灵敏、特异性强，更关键的是能够直观地、可视化地辨别不同种类的临床致病菌。

2、技术方案：为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

3、本发明的第一个发明目的是：提供一类硝基还原酶开启式的半菁染料荧光探针，其结构通式为：

4、

5、其中，r1、r2、r3、r4、r6、r7、r8、r9可独立地选为h、f、cl、br、i、ch3、oh、cooh、och3、sch3、so3h、no2或ph；或r1与r2、r2与r3、r3与r4、r6与r8、r7与r9相邻之间以苯环、萘环、蒽环或菲环的形式并联；

6、r5可选为ch3、ch2ch3、ch2ch2ch3、(ch2)2oh、(ch2)3so3-或(ch2)4so3-；

7、r10可选为苯、甲基苯、萘、甲基萘、蒽、甲基蒽、菲、甲基菲、呋喃、甲基呋喃、噻吩、甲基噻吩、吡咯、甲基吡咯、吡啶、甲基吡啶、噻唑、甲基噻唑、恶唑、甲基恶唑、咪唑、甲基咪唑、噻嗪、甲基噻嗪、嘧啶、甲基嘧啶、嘌呤或甲基嘌呤；

8、x可选为o、s、se、c、chch3或c(ch3)2；

9、y可选为cl、br、i或tso；

10、z可选为o、s、nh或ph；

11、n可选为0、1或2。

12、优选结构为：r1＝h；r2＝h；r3＝h；r4＝h；r5＝ch3或ch2ch3；r6＝h；r7＝h；r8＝h或och3；r9＝h或och3；r10＝苯或甲基苯；x＝s或c(ch3)2；y＝br或i；z＝o或s；n＝0或1。

13、更优选的，r1＝h；r2＝h；r3＝h；r4＝h；r5＝ch2ch3；r6＝h；r7＝h；r8＝och3；r9＝och3；r10＝甲基苯；x＝s；y＝i；z＝o；n＝0。

14、本发明的第二个发明目的是：提供如式i所示的半菁染料荧光探针的制备方法，合成路线如下：

15、

16、其中，r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9、r10、x、y、z、n的选择及优选结构同上述式i的要求；

17、a可选为cl、br或i，优选结构为br。

18、一种半菁染料荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

19、a：将含氮杂环与亲电试剂按摩尔比(0.5～4):1混合，反应温度120～190℃，反应时间4～10h；或将含氮杂环与亲电试剂按摩尔比(0.5～4):1混合，超干乙腈作溶剂，反应温度60～100℃，反应时间4～10h；

20、b：将芳醛类衍生物和硝基化合物按摩尔比(0.5～1):1混合，超干乙腈作溶剂，碘化钾和碳酸铯作催化剂，反应温度60～100℃，反应时间4～10h；

21、c：将步骤a和步骤b制得的两类产物按摩尔比(0.5～1):1混合，超干乙腈作溶剂，三乙胺作催化剂，反应温度60～100℃，反应时间4～10h；或将步骤a和步骤b制得的两类产物按摩尔比(0.5～1):1混合，无水乙醇作溶剂，无水乙酸钠作催化剂，反应温度60～100℃，反应时间1～5h；或将步骤a和步骤b制得的两类产物按摩尔比(0.5～1):1混合，超干吡啶作溶剂，反应温度60～100℃，反应时间1～5h；或将步骤a和步骤b制得的两类产物按摩尔比(0.5～1):1混合，乙酸酐作溶剂，无水乙酸钠作催化剂，反应温度100～150℃，反应时间1～5h。

22、结合上述反应式，制备方式及优选的反应条件如下：

23、a：将化合物1与化合物2按摩尔比(0.5～4):1混合，反应温度120～190℃，反应时间4～10h，优选170℃、8h；将化合物1与化合物2按摩尔比(0.5～4):1混合，超干乙腈作溶剂，反应温度60～100℃，反应时间4～10h，优选85℃、8h；

24、b：将化合物4和化合物5按摩尔比(0.5～1):1混合，超干乙腈作溶剂，碘化钾和碳酸铯作催化剂，反应温度60～100℃，反应时间4～10h，优选85℃、8h；

25、c：①将化合物3和化合物6按摩尔比(0.5～1):1混合，超干乙腈作溶剂，三乙胺作催化剂，反应温度60～100℃，反应时间4～10h，优选65℃、8h；②将化合物3和化合物6按摩尔比(0.5～1):1混合，无水乙醇作溶剂，无水乙酸钠作催化剂，反应温度60～100℃，反应时间1～5h，优选80℃、3h；③将化合物3和化合物6按摩尔比(0.5～1):1混合，超干吡啶作溶剂，反应温度60～100℃，反应时间1～5h，优选80℃、3h；④将化合物3和化合物6按摩尔比(0.5～1):1混合，乙酸酐作溶剂，无水乙酸钠作催化剂，反应温度100～150℃，反应时间1～5h，优选130℃、3h。

26、本发明的机理如下：

27、

28、本发明所述荧光探针是基于半菁染料母核结构。它通常是通过中间的次甲基链，一端连接带正电的含氮杂环，另一端连接带有给电子基团(如羟基、氨基、甲氧基等)的环结构，整个分子形成“电子供体-π-电子受体”(d-π-a)体系，因此半菁染料荧光探针的发光机制通常是基于分子内电荷转移(ict)效应。在荧光探针结构中引入响应基团(即硝基)后，硝基作为强吸电子基，会导致分子产生光致电子转移(pet)效应，致使探针自身的荧光被显著猝灭，在溶液中几乎显示为无色状态。而当荧光探针与硝基还原酶作用后，吸电子性的硝基被还原为给电子性的氨基，pet过程被阻断，ict机制被恢复，因此探针的荧光得以实现“开启”，并且在溶液中也呈现出酶切产物半菁染料相应的颜色。

29、上述此类荧光探针在nad(p)h的辅助下，能够与硝基还原酶特异性反应，吸光度值和荧光强度随着硝基还原酶浓度的增加而逐渐升高。肉眼可见样品颜色发生转变，由无色逐渐变为有色，这取决于酶切产物半菁染料在溶液中的颜色。

30、与现有技术中的检测限相比，如：chem.commun.2017,53,11177-11180、clin.microbiol.rev.2018,32,e00037-18、anal.chem.2019,91,1286-1294、sci.rep.2020,10,11900，本发明可根据肉眼更加方便快捷地鉴定临床致病菌，而无需高昂的仪器和复杂的操作。

31、本发明的第三个发明目的是：提供如式i所示的半菁染料荧光探针在溶液、细菌体系中检测硝基还原酶的应用。所述溶液可以为水溶性或有机溶剂体系，所述细菌可以为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。包括如下步骤：

32、a：称取一定质量的荧光探针固体溶解于二甲基亚砜中制得荧光探针母液，称取一定质量的nadh固体溶解于ph为7.2、浓度为10mm的pbs中制得nadh母液，称取一定质量的硝基还原酶固体溶解于ph为7.2、浓度为10mm的pbs中制得硝基还原酶母液；

33、b：分别吸取一定量的荧光探针母液、nadh母液和硝基还原酶母液依次释于pbs中，其中荧光探针和nadh为固定浓度，硝基还原酶为浓度梯度变化，混匀后37℃下孵育2h；

34、c：测试样品的吸收光谱和荧光光谱，其中测试吸收光谱前用pbs校准基线，并以最大吸收波长作为激发波长采集荧光光谱；

35、d：读取荧光峰处的峰值强度，以硝基还原酶浓度为横坐标，峰值强度为纵坐标绘制散点图，在线性范围内拟合直线方程得到标准曲线y＝0.069+1.249x；

36、e：待测样本如上处理后，测试样本中荧光探针的吸收光谱和荧光光谱并读取峰值，将荧光峰值强度代入上述标准曲线中计算得出溶液样本、细菌样本中硝基还原酶浓度。

37、本发明的第四个发明目的是：提供如式i所示的半菁染料荧光探针可视化鉴定临床致病菌的方法，包括如下步骤：

38、a：准确称取一定质量的荧光探针固体溶解于二甲基亚砜中制得1mm的母液；

39、b：将lb培养基中过夜培养的细菌菌株接种于1％v/v的新鲜lb培养基中，37℃下培养；

40、c：将达到对数中期的细菌离心，然后洗涤两次，用ph为7.4、浓度为50mm的tris-hcl缓冲溶液重新悬浮在原始体积中；

41、d：确定细菌的最低可检测cfu，细菌溶液被稀释并用平板计数；

42、e：向细菌悬液内加入一定量的荧光探针，37℃下孵育1h，随后测定溶液的荧光强度并记录样品的直观颜色。

43、本发明的有益效果：

44、本发明基于半菁染料结构，提供了一类硝基还原酶荧光探针及其制备方法、检测方法以及在溶液及细菌体系中的可视化应用。此类半菁染料荧光探针结构简单、可设计性强，制备方法简便且适用范围广。本发明基于此类半菁染料荧光探针，实现了溶液中硝基还原酶的灵敏识别和检测，并给出了标准曲线拟合方程式，可实现样本中硝基还原酶含量的精准测定。本发明所述半菁染料荧光探针成功实现了临床上重要细菌的可视化鉴定，为临床致病菌的灵敏检测和便捷鉴定提供了一类分子工具。