一种用于检测抗抑郁用药相关基因的引物探针组、试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及基因检测，特别涉及一种用于检测抗抑郁用药相关基因的引物探针组、试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、据统计，全球约有3.22亿抑郁障碍患者，占世界人口的4.4％，对于抑郁症患者最有效的治疗方式是药物治疗，当前临床上常用的抗抑郁药如下表所示：

2、表2

3、

4、但是目前抑郁症治疗所面临的临床问题仍然存在，处于“经验化”或“试错法”治疗阶段，药物应答率低，具体的单一用药有效率1/3，并且疾病异质性及药物治疗个体差异大，研究表明导致药物治疗出现较大个人差异的原因除了传统上的病理、生理、性别、年龄、身高、体重等方面外，药物代谢酶的遗传多态性是药物发挥疗效时引发个体差异的重要因素，其对个体差异的贡献42％-50％。经长期研究已发现有许多基因突变与人体对抗抑郁药物的反应性有关，已发现的在亚洲人中常见的抗抑郁药物治疗相关基因突变及其相关药物如下表3所示：

5、表3

6、

7、

8、随着药物基因组学的飞速发展，通过对药物疗效和不良反应的基因多态性的检测有利于指导药物的选择和剂量的调整，实现个体化用药的目的。目前市场上针对抗抑郁用药相关基因多态性位点检测的方法大多采用飞行时间质谱技术、多重pcr和ce分离技术相结合的检测技术，如中国专利号cn110129432a公开了一种个体化用药相关基因多态性的检测方法，其检测过程涉及待测样本核酸的提取、pcr扩增反应、消化处理、延伸反应、脱盐纯化处理步骤，再进行质谱仪的检测，虽然该技术检测通量高，但是整个检测过程步骤繁琐，涉及多次的开关盖添加反应物的过程，检测灵敏度较低。此外，中国专利号cn109825573a还公开了一种用于抗抑郁药物用药指导的多重基因检测试剂盒及其使用方法，其中涉及多重pcr和ce分离技术相结合的检测技术，具体的，检测与抗抑郁药物代谢、转运、靶点作用相关的cyp2d6、cyp2c19、abcb1和fkbp5等4个基因上7个单核苷酸多态性(snp)位点，检测周期长(2.5小时)且检测步骤繁琐，不仅需要配制pcr反应体系还需要配制电泳样品，同时检测位点较少，存在因单个药物结果不理想需要再评估其他药物的用药风险而再次检测相关基因的问题。

9、鉴于此，有必要建立一种同时快速检测抑郁障碍相关位点多态性的核酸检测试剂盒，为医院及其它检测机构提供一种操作简单、特异性强、灵敏度高、可靠性强和成本低的检测方案。

技术实现思路

1、本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种用于检测抗抑郁用药相关基因的引物探针组、试剂盒、检测方法及应用，以克服现有检测方案所存在的不足。

2、本发明采用的技术方案如下：一种用于检测抗抑郁用药相关基因的引物探针组，所述引物探针组用于检测抗抑郁用药相关基因的16个snp位点，相关snp位点包括：cyp2c19c.681g＞a(rs4244285)、cyp2c19 c.636g＞a(rs4986893)、cyp2c19 c.806c＞t(rs12248560)；abcb1 c.2677t＞g/a(rs2032582)、abcb1 c.3435t＞c(rs1045642)；cyp2d6c.100c＞t(rs1065852)、cyp2d6 c.1846g＞a(rs3892097)、cyp2d6 c.1758g＞a(rs5030865)、cyp2d6c.2988g＞a(rs28371725)；thr2ag.64185a＞g(rs7997012)；fkbp5g.93790t＞c(rs1360780)；htr2ag.42815c＞g(rs9316233)；bmp5 c.846g＞a(rs41271330)；htr1a g.4555c＞g(rs6295)；fkbp5 g.31378a＞g(rs4713916)；ncam1g.284533t＞c(rs2303377)。引物探针组的核苷酸序列如表1所示：

3、表1

4、

5、

6、

7、

8、其中，在表1的引物名称列表中，-r表示反向通用引物，-f表示正向通用引物，-p表示荧光探针，-mf表示正向突变型引物，-wf表示正向野生型引物，-mr表示反向突变型引物，-wr表示反向野生型引物；在表1的引物序列列表中，单下划线表示序列的3’端引入错配碱基，双下划线表示序列的5’端引入错配碱基。

9、在表1中，用于检测rs1045642位点的特异性引物探针组为核苷酸序列如seq idno.1所示的正向野生型引物、核苷酸序列如seq id no.2所示的正向突变型引物、核苷酸序列如seq id no.3所示的通用引物以及核苷酸序列如seq id no.4所示的荧光探针；

10、用于检测rs2032582位点的特异性引物探针组为核苷酸序列如seq id no.5所示的反向野生型引物、核苷酸序列如seq id no.6、seq id no.9所示的反向突变型引物、核苷酸序列如seq id no.7所示的通用引物以及核苷酸序列如seq id no.8所示的荧光探针；

11、用于检测rs1065852位点的特异性引物探针组为核苷酸序列如seq id no.11所示的正向野生型引物、核苷酸序列如seq id no.10所示的正向突变型引物、核苷酸序列如seqid no.12所示的通用引物以及核苷酸序列如seq id no.13所示的荧光探针；

12、用于检测rs3892097位点的特异性引物探针组为核苷酸序列如seq id no.14所示的反向野生型引物、核苷酸序列如seq id no.15所示的反向突变型引物、核苷酸序列如seqid no.16所示的通用引物以及核苷酸序列如seq id no.17所示的荧光探针；

13、用于检测rs28371725位点的特异性引物探针组为核苷酸序列如seq id no.18所示反向野生型引物、核苷酸序列如seq id no.19所示的反向突变型引物、核苷酸序列如seqid no.20所示的通用引物以及核苷酸序列如seq id no.21所示的荧光探针；

14、用于检测rs5030865位点的特异性引物探针组，核苷酸序列如seq id no.22所示正向野生型引物、核苷酸序列如seq id no.23所示的正向突变型引物、核苷酸序列如seqid no.24所示的通用引物以及核苷酸序列如seq id no.25所示的荧光探针；

15、用于检测rs4244285位点的特异性引物探针组为核苷酸序列如seq id no.26所示正向野生型引物、核苷酸序列如seq id no.27所示的正向突变型引物、核苷酸序列如seqid no.28所示的通用引物以及核苷酸序列如seq id no.29所示的荧光探针；

16、用于检测rs4986893位点的特异性引物探针组为核苷酸序列如seq id no.30所示反向野生型引物、核苷酸序列如seq id no.31所示的反向突变型引物、核苷酸序列如seqid no.32所示的通用引物以及核苷酸序列如seq id no.33所示的荧光探针；

17、用于检测rs12248560位点的特异性引物探针组为核苷酸序列如seq id no.34所示正向野生型引物、核苷酸序列如seq id no.35所示的正向突变型引物、核苷酸序列如seqid no.36所示的通用引物以及核苷酸序列如seq id no.37所示的荧光探针；

18、用于检测rs6295位点的特异性引物探针组为核苷酸序列如seq id no.38所示正向野生型引物、核苷酸序列如seq id no.39所示的正向突变型引物、核苷酸序列如seq idno.40所示的通用引物以及核苷酸序列如seq id no.41所示的荧光探针；

19、用于检测rs4713916位点的特异性引物探针组为核苷酸序列如seq id no.42所示反向野生型引物、核苷酸序列如seq id no.43所示的反向突变型引物、核苷酸序列如seqid no.44所示的通用引物以及核苷酸序列如seq id no.45所示的荧光探针；

20、用于检测rs9316233位点的特异性引物探针组为核苷酸序列如seq id no.46所示反向野生型引物、核苷酸序列如seq id no.47所示的反向突变型引物、核苷酸序列如seqid no.48所示的通用引物以及核苷酸序列如seq id no.49所示的荧光探针；

21、用于检测rs1360780位点的特异性引物探针组为核苷酸序列如seq id no.50所示反向野生型引物、核苷酸序列如seq id no.51所示的反向突变型引物、核苷酸序列如seqid no.52所示的通用引物以及核苷酸序列如seq id no.53所示的荧光探针；

22、用于检测rs7997012位点的特异性引物探针组为核苷酸序列如seq id no.54所示反向野生型引物、核苷酸序列如seq id no.55所示的反向突变型引物、核苷酸序列如seqid no.56所示的通用引物以及核苷酸序列如seq id no.57所示的荧光探针；

23、用于检测rs2303377位点的特异性引物探针组为核苷酸序列如seq id no.58所示正向野生型引物、核苷酸序列如seq id no.59所示的正向突变型引物、核苷酸序列如seqid no.60所示的通用引物以及核苷酸序列如seq id no.61所示的荧光探针；

24、用于检测rs41271330位点的特异性引物探针组为核苷酸序列如seq id no.62所示反向野生型引物、核苷酸序列如seq id no.63所示的反向突变型引物、核苷酸序列如seqid no.64所示的通用引物以及核苷酸序列如seq id no.65所示的荧光探针。

25、进一步，荧光探针的5’端连接有荧光基团，其3’端连接有淬灭基团，所述荧光基团选自fam、texas red、hex、cy5、alexa fluor 680、rox其中任意一种荧光染料，所述淬灭基团选自bhq1、bhq2其中任意一种荧光染料。

26、进一步，本发明还包括一种用于检测抗抑郁用药相关基因的试剂盒，它包括上述引物探针组。

27、进一步，所述试剂盒还包括用于对人基因组dna内标基因进行检测的通用引物和通用探针；所述人基因组dna内标基因为rpph，所述用于对人基因组dna内标基因进行检测的通用引物核苷酸序列如seq id no.66-67所示，所述用于对人基因组dna内标基因进行检测的通用探针核苷酸序列如seq id no.68所示。

28、进一步，所述试剂盒包括野生型反应体系和突变型反应体系，所述野生型反应体系包括：

29、pcr预混液w1，包括用于检测abcb1 c.3435t＞c位点的正向野生型引物、通用引物和荧光探针；用于检测abcb1 c.2677t＞g/a位点的反向野生型引物、通用引物和荧光探针；

30、pcr预混液w2，包括用于abcb1 c.2677t＞g/a位点的反向野生型引物、通用引物和荧光探针；

31、pcr预混液w3，包括用于检测cyp2d6 c.100c＞t位点的正向野生型引物、通用引物和荧光探针；用于检测cyp2d6 c.1846g＞a位点的反向野生型引物、通用引物和荧光探针；

32、pcr预混液w4，包括用于检测cyp2d6 c.2988g＞a位点的反向野生型引物、通用引物和荧光探针；用于检测cyp2d6 c.1758g＞a位点的正向野生型引物、通用引物和荧光探针；

33、pcr预混液w5，包括用于检测cyp2c19 c.681g＞a位点的正向野生型引物、通用引物和荧光探针；用于检测cyp2c19 c.636g＞a位点的反向野生型引物、通用引物和荧光探针；用于检测cyp2c19 c.806c＞t位点的正向野生型引物、通用引物和荧光探针；

34、pcr预混液w6，用于检测htr1ag.4555c＞g位点的正向野生型引物、通用引物和荧光探针；用于检测fkbp5 g.31378a＞g位点的反向野生型引物、通用引物和荧光探针；

35、pcr预混液w7，用于检测htr2ag.42815c＞g位点的反向野生型引物、通用引物和荧光探针；用于检测fkbp5 g.93790t＞c位点的反向野生型引物、通用引物和荧光探针；

36、pcr预混液w8，用于检测htr2ag.64185a＞g位点的反向野生型引物、通用引物和荧光探针；用于检测ncam1 g.284533t＞c位点的正向野生型引物、通用引物和荧光探针；用于检测bmp5 c.846g＞a位点的反向野生型引物、通用引物和荧光探针；

37、所述突变型反应体系包括：

38、pcr预混液m1，包括用于检测abcb1 c.3435t＞c位点的正向突变型引物、通用引物和荧光探针；用于检测abcb1 c.2677t＞g/a位点的反向突变型引物、通用引物和荧光探针；

39、pcr预混液m2，包括用于检测abcb1 c.2677t＞g/a位点的反向突变型引物、通用引物和荧光探针；

40、pcr预混液m3，包括用于检测cyp2d6 c.100c＞t位点的正向突变型引物、通用引物和荧光探针；用于检测cyp2d6 c.1846g＞a位点的反向突变型引物、通用引物和荧光探针；

41、pcr预混液m4，包括用于检测cyp2d6 c.2988g＞a位点的反向突变型引物、通用引物和荧光探针；用于检测cyp2d6 c.1758g＞a位点的正向突变型引物、通用引物和荧光探针；

42、pcr预混液m5，包括用于检测cyp2c19 c.681g＞a位点的正向突变型引物、通用引物和荧光探针；用于检测cyp2c19 c.636g＞a位点的反向突变型引物、通用引物和荧光探针；用于检测cyp2c19 c.806c＞t位点的正向突变型引物、通用引物和荧光探针；

43、pcr预混液m6，包括用于检测htr1ag.4555c＞g位点的正向突变型引物、通用引物和荧光探针；用于检测fkbp5 g.31378a＞g位点的反向突变型引物、通用引物和荧光探针；

44、pcr预混液m7，包括用于检测htr2ag.42815c＞g位点的反向突变型引物、通用引物和荧光探针；用于检测fkbp5 g.93790t＞c位点的反向突变型引物、通用引物和荧光探针；

45、pcr预混液m8，包括用于检测htr2ag.64185a＞g位点的反向突变型引物、通用引物和荧光探针；用于检测ncam1 g.284533t＞c位点的正向突变型引物、通用引物和荧光探针；用于检测bmp5 c.846g＞a位点的反向突变型引物、通用引物和荧光探针。

46、进一步，pcr预混液w1-w8和pcr预混液m1-m8中引物探针的浓度范围为0.15μm-1μm。

47、进一步，pcr预混液w1中用于检测abcb1 c.3435t＞c、abcb1 c.2677t＞g/a位点的野生型引物探针的加量范围为：0.15μm-0.3μm；

48、pcr预混液m1中用于检测abcb1 c.3435t＞c、abcb1 c.2677t＞g/a位点的突变型引物探针的加量范围为：0.15μm-0.75μm；

49、pcr预混液w2中用于检测abcb1 c.2677t＞g/a位点的野生型引物探针的加量范围为：0.15μm-0.2μm；

50、pcr预混液m2中用于检测abcb1 c.2677t＞g/a位点的突变型引物探针的加量范围为：0.15μm-0.2μm；

51、pcr预混液w3中用于检测cyp2d6 c.100c＞t、cyp2d6 c.1846g＞a位点的野生型引物探针的加量范围为：0.15μm-1μm；

52、pcr预混液m3中用于检测cyp2d6 c.100c＞t、cyp2d6 c.1846g＞a位点的突变型引物探针的加量范围为：0.15μm-1μm；

53、pcr预混液w4中用于检测cyp2d6 c.2988g＞a、cyp2d6 c.1758g＞a位点的野生型引物探针的加量范围为：0.15μm-0.25μm；

54、pcr预混液m4中用于检测cyp2d6 c.2988g＞a、cyp2d6 c.1758g＞a位点的突变型引物探针的加量范围为：0.15μm-0.5μm；

55、pcr预混液w5中用于检测cyp2c19 c.681g＞a、cyp2c19 c.636g＞a、cyp2c19c.806c＞t位点的野生型引物探针的加量范围为：0.15μm-0.5μm；

56、pcr预混液m5中用于检测cyp2c19 c.681g＞a、cyp2c19 c.636g＞a、cyp2c19c.806c＞t位点的突变型引物探针的加量范围为：0.15μm-0.5μm；

57、pcr预混液w6中用于检测htr1ag.4555c＞g、fkbp5 g.31378a＞g位点的野生型引物探针的加量范围为：0.15μm-0.25μm；

58、pcr预混液m6中用于检测htr1ag.4555c＞g、fkbp5 g.31378a＞g位点的突变型引物探针的加量范围为：0.15μm-0.25μm；

59、pcr预混液w7中用于检测htr2ag.42815c＞g、fkbp5 g.93790t＞c位点的野生型引物探针的加量范围为：0.15μm-0.25μm；

60、pcr预混液m7中用于检测htr2ag.42815c＞g、fkbp5 g.93790t＞c位点的突变型引物探针的加量范围为：0.15μm-0.25μm；

61、pcr预混液w8中用于检测htr2ag.64185a＞g、ncam1 g.284533t＞c、bmp5c.846g＞a位点的野生型引物探针的加量范围为：0.15μm-0.25μm；

62、pcr预混液m8中用于检测htr2ag.64185a＞g、ncam1 g.284533t＞c、bmp5c.846g＞a位点的突变型引物探针的加量范围为：0.15μm-0.25μm。

63、进一步，所述pcr预混液w1-w8和pcr预混液m1-m8中还包括mgcl2、dntps、tris、taq酶及buffer。

64、进一步，所述试剂盒还包括用于释放待测样本核酸的样本稀释液，所述样本稀释液包含sds、甲酰胺和hcl。

65、进一步，本发明还包括一种试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

66、a、采用所述用于处理待测样本核酸释放剂释放待测样本的dna；

67、b、在预混液w1-w8、预混液m1-m8中直接加入所述步骤s1处理后的待测样本进行充分混匀；

68、c、荧光定量pcr扩增反应程序为：

69、预变性反应：95℃反应3min；

70、扩增反应：95℃反应15s，60℃反应30s，45个循环；

71、d、待测样本基因型判定。

72、综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

73、1、本发明针对抑郁相关的8个基因16个主要突变位点设计了特异性的引物探针组并配合pcr预混液体系，特异性强，可准确检测低至0.25ng/μl的基因组dna，灵敏度较高，通过引入内参基因，对检测过程进行全程质量监控，有效避免了假阳性或者假阴性的情况，检测结果可同时指导西酞普兰、艾司西酞普兰、舍曲林、帕罗西汀、氟伏沙明、氟西汀、文拉法辛、度洛西汀、米氮平、阿戈美拉汀的个体化用药；

74、2、本发明的试剂盒通过设置pcr预混液w1-w8和m1-m8，免除了繁琐的pcr扩增体系配制步骤，减少了操作误差，方便用户使用、准确度高；同时针对同一反应体系中检测各位点的引物类型的组合探究，使得反应体系中各位点的扩增效率保持一致，减少了因相互竞争资源各位点扩增过程中压制现象；

75、3、本发明的试剂盒的检测方法经济、高效、快速，可实现1小时左右出结果，大大降低了成本；同时，各位点通过设置两管反应体系，检测结果容易判读，为临床医生提供了更多的患者基因信息，为抗抑郁用药的使用提供了更完善的个性化用药参考，使患者受益。