用于检测曲霉属的引物探针组合及其试剂盒的制作方法

本发明涉及生物基因，尤其涉及用于检测曲霉属的引物探针组合及其试剂盒。

背景技术：

1、真菌属于真核生物，广泛存在于自然界，绝大多数具有重要的经济意义，少数会感染植物、动物和人类。致病真菌病分为浅部真菌病和深部真菌病(侵袭性真菌病，ifi/ifds)，侵袭性真菌主要有假丝酵母菌、隐球菌、曲霉、毛霉、组织胞浆菌和卡氏肺孢菌等，其中以假丝酵母菌感染最多，其次为曲霉感染，且侵袭性曲霉感染率逐年增加。

2、引起侵袭性曲霉感染的主要是条件致病菌曲霉菌，目前已知的曲霉属在自然界有600多种，可分为18个群，132个种和18个变种，其中有40种能引起人类感染，以烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、杂色曲霉、棒曲霉等比较常见，烟曲霉是曲霉菌病的主要致病菌，其次是黄曲霉。在我国，曲霉感染中烟曲霉感染率高达46％～60％，黄曲霉感染率在27％～36％之间。

3、目前侵袭性曲霉病临床常用的检测方法有很多，如g试验、gm试验、抗体检测、病理性检测、培养等，这些方法敏感性及特异性不高，检出率低，造成曲霉病临床诊断困难，误诊率极高。

技术实现思路

1、本发明提供用于检测曲霉属的引物探针组合及其试剂盒，以解决现有的曲霉检测技术灵敏度低、特异性差的问题。

2、第一方面，本发明提供的用于检测曲霉属的引物探针组合，包括：引物探针组1、引物探针组2、引物探针组3中的任意一组；

3、所述引物探针组1包括：第一引物、第二引物和探针1；

4、所述第一引物具有：如seq id no:1所示的核苷酸序列；

5、所述第二引物具有：如seq id no:2所示的核苷酸序列；

6、所述探针1具有：如seq id no:19所示的核苷酸序列；

7、所述引物探针组2包括：第三引物、第四引物和探针2；

8、所述第三引物具有：如seq id no:3所示的核苷酸序列；

9、所述第四引物具有：如seq id no:4所示的核苷酸序列；

10、所述探针2具有：如seq id no:20所示的核苷酸序列；

11、所述引物探针组3包括：第五引物、第六引物和探针3；

12、所述第五引物具有：如seq id no:5所示的核苷酸序列；

13、所述第六引物具有：如seq id no:6所示的核苷酸序列；

14、所述探针3具有：如seq id no:21所示的核苷酸序列；

15、其中，所述探针1、探针2和探针3均包括：淬灭基团和荧光基团。

16、进一步，本发明所述的用于检测曲霉属的引物探针组合，还包括：用于检测黄曲霉的引物探针组；

17、所述用于检测黄曲霉的引物探针组包括：引物探针组4、引物探针组5、引物探针组6中的任意一组；

18、所述引物探针组4包括：第七引物、第八引物和探针4；

19、所述第七引物具有：如seq id no:7所示的核苷酸序列；

20、所述第八引物具有：如seq id no:8所示的核苷酸序列；

21、所述探针4具有：如seq id no:22所示的核苷酸序列；

22、所述引物探针组5包括：第九引物、第十引物和探针5；

23、所述第九引物具有：如seq id no:9所示的核苷酸序列；

24、所述第十引物具有：如seq id no:10所示的核苷酸序列；

25、所述探针5具有：如seq id no:23所示的核苷酸序列；

26、所述引物探针组6包括：第十一引物、第十二引物和探针6；

27、所述第十一引物具有：如seq id no:11所示的核苷酸序列。

28、所述第十二引物具有：如seq id no:12所示的核苷酸序列；

29、所述探针6具有：如seq id no:24所示的核苷酸序列；

30、其中，所述探针4、探针5和探针6均包括：淬灭基团和荧光基团。

31、进一步，本发明所述的用于检测曲霉属的引物探针组合，还包括：用于检测烟曲霉的引物探针组；

32、所述用于检测烟曲霉的引物探针组包括：引物探针组7、引物探针组8、引物探针组9中的任意一组；

33、所述引物探针组7包括：第十三引物、第十四引物和探针7；

34、所述第十三引物具有：如seq id no:13所示的核苷酸序列；

35、所述第十四引物具有：如seq id no:14所示的核苷酸序列；

36、所述探针7具有：如seq id no:25所示的核苷酸序列；

37、所述引物探针组8包括：第十五引物、第十六引物和探针8；

38、所述第十五引物具有：如seq id no:15所示的核苷酸序列；

39、所述第十六引物具有：如seq id no:16所示的核苷酸序列；

40、所述探针8具有：如seq id no:26所示的核苷酸序列；

41、所述引物探针组9包括：第十七引物、第十八引物和探针9；

42、所述第十七引物具有：如seq id no:17所示的核苷酸序列；

43、所述第十八引物具有：如seq id no:18所示的核苷酸序列；

44、所述探针9具有：如seq id no:27所示的核苷酸序列；

45、其中，所述探针7、探针8和探针9均包括：淬灭基团和荧光基团。

46、进一步，本发明所述的用于检测曲霉属的引物探针组合，还包括：内标引物组和内标探针；

47、所述内标引物组包括：第十九引物和第二十引物；

48、所述第十九引物具有：如seq id no:28所示的核苷酸序列；

49、所述第二十引物具有：如seq id no:29所示的核苷酸序列；

50、所述内标探针具有：如seq id no:30所示的核苷酸序列。

51、第二方面，本发明提供的试剂盒，包括：如本发明所述的用于检测曲霉属的引物探针组合。

52、进一步，本发明所述的试剂盒，包括如本发明第一方面所述的引物探针组1、引物探针组4和引物探针组7。

53、进一步，本发明所述的试剂盒，还包括如本发明第一方面所述的内标引物组和内标探针。

54、进一步，本发明所述的试剂盒，所述第一引物、所述第二引物、所述第七引物、所述第八引物的浓度均为400nm，所述第十三引物、所述第十四引物、所述第十九引物、所述第二十引物的浓度均为200nm；所述探针1的浓度为200nm，所述探针4、所述探针7的浓度均为150nm，所述内标探针的浓度为100nm。

55、进一步，本发明所述的试剂盒，所述引物组、所述探针、所述引物探针组合均采用冻干体系制备。

56、本发明提供的用于检测曲霉属的引物探针组合及其试剂盒，通过对大量序列筛选及比对，选在曲霉属保守区域以及烟曲霉、黄曲霉特异性区域设计引物和探针，可以快速检测曲霉属、烟曲霉和黄曲霉，具有灵敏度高，受干扰物质影响小的技术优势，最低检测限可以达到1cfu/pcr反应，同时检测速度快，将整个检测时间缩短至1.5小时以内，真正的实现了快速、准确检测。