一种高活性的肌酐酶及其冻干剂的制作方法

本技术属于生物，涉及一种高活性的肌酐酶及肌酐酶的冻干剂。

背景技术：

1、肌酐是人体肌肉中的肌酸通过自发的且不可逆转的过程形成的，在肾脏功能正常情况下，肌酐在血液中的浓度维持在一个较低的水平，而肾脏功能不全时，会导致肌酐在血清中的积累，血清中肌酐含量是反映肾脏功能的重要指标。

2、对于肌酐的检测，应用最为广泛的是碱性苦味酸法，即以肌酸为底物，在肌酐酶的催化作用下使肌酸转化为肌酐，肌酐在碱性条件下与苦味酸发生反应，生成橘黄色产物，在520nm的可见波长下其浓度与吸光度成正比，因此可以通过测定肌酐的生成量来测定肌酐酶酶活。但存在着反应特异性差与灵敏度有限的问题，目前正逐渐被酶法(肌酐酶偶联肌氨酸氧化酶法)检测所替代，其中肌酐酶(肌酐酰胺水解酶，creatininase，ec.3.5.2.10，简称cine)、肌酸酶和肌氨酸氧化酶是三个关键性的酶，肌酐酶水解肌酐生成肌酸，肌酸酶催化肌酸水解产生肌氨酸和尿素，肌氨酸在肌氨酸氧化酶作用下水解生成甲醛、甘氨酸和h2o2，偶联trinder反应，通过比色测定，计算出样品中肌酐的含量。酶法具有抗干扰能力强、特异性好、线性范围宽、灵敏度高等特点，商品化的试剂盒大多采用肌酐酶偶联肌氨酸氧化酶法，在临床上得到了越来越多的使用。

3、肌酐酶是酶法检测肌酐的核心原料，因此肌酐酶的制备方法和长期储存稳定性具有重要意义。目前，工业生产肌酐酶多采用基因工程菌发酵的方法，但野生酶产量极低、活性差，难以进行工业化利用。中国的专利申请文件cn115820614a中公开了一种肌酐酶的制备方法及发酵培养基，通过在发酵培养基中加入各种金属盐离子可以提高酶活性，但是在工业化生产尤其是高密度发酵时，添加重金属离子会使菌体生长受限，影响最终菌体量和肌酐酶总量。此外，酶制剂在保存时会受到环境因素的影响，温度或高或温差过大都会使酶制剂产生失活的现象。目前常用的酶制剂保存方法通常包括：1.低温保存，2.结晶保存，3.加入保护剂冻干保存。冻干粉有便于产品运输、储存时占地面积小等液体酶制剂不具备的优点，但冻干保护剂的选择也直接影响了冻干酶制剂的储存稳定性。因此为了减少肌酐酶活性在冻干过程中的损伤，筛选合适的冻干保护剂尤为重要。

技术实现思路

1、针对目前肌酐酶产量低、活性差且液体酶储存不方便的状况，寻找一种便于工业化生产、产量高、活性好且运输方便的肌酐酶突变体和其冻干剂生产的方法。

2、一方面，本技术提供一种高活性的肌酐酶突变体。

3、在一些实施方案中，所述突变体与氨基酸序列如seq id no：1所示的野生型肌酐酶相比，含有以下位点上的氨基酸取代：第144位。在一些实施方案中，所述突变体与氨基酸序列如seq id no：1所示的野生型肌酐酶相比，还含有以下位点上的氨基酸取代：第165位。在一些实施方案中，所述突变体与氨基酸序列如seq id no：1所示的野生型肌酐酶相比，还含有以下位点上的氨基酸取代：第198位。在一些实施方案中，突变体与氨基酸序列如seqid no：1所示的野生型肌酐酶相比，含有下列位点上的氨基酸取代组合：第144位、第165位、第198位。

4、在一些实施方案中，所述突变体包含h144t、r165e、e198t取代。在一些实施方案中，所述突变体的序列如seq id no：5所示。

5、另一方面，本技术提供一种多核苷酸，其编码本技术的肌酐酶突变体。在一些实施方案中，所述多核苷酸的序列如seq id no：6所示。

6、另一方面，本技术还提供一种表达载体，其掺入本技术的多核苷酸。在一些实施方案中，所述表达载体掺入有如seq id no：6所示的多核苷酸。在一些实施方案中，所述表达载体是pet载体，具体是pet28a。

7、另一方面，本技术还提供一种宿主细胞，其用本技术所述的多核苷酸转化并表达所述多核苷酸。在一些实施方案中，所述宿主细胞用包含如seq id no：6所示的多核苷酸转化并表达所述多核苷酸。本技术还提供一种宿主细胞，其被用本技术所述的表达载体转化。在一些实施方案中，所述宿主细胞被用掺入有包含seq id no：6所示的多核苷酸的表达载体转化。

8、另一方面，本技术还提供一种在宿主细胞中生产本技术的肌酐酶突变体的方法，所述方法包括在使得产生本技术的突变体的培养条件下培养本技术所述的宿主细胞。在一些实施方案中，所述生产本技术的肌酐酶突变体的方法还包括从培养物和/或宿主细胞回收肌酐酶突变体。在一些实施方案中，还包括对宿主细胞使用异丙基硫代半乳糖苷(iptg)诱导蛋白表达的步骤。在一些实施方案中，所述生产本技术的肌酐酶突变体的方法还包括纯化所述肌酐酶突变体的步骤。在一些实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)。

9、另一方面，本技术还提供一种肌酐酶的冻干剂，包含海藻糖、金属盐和肌酐酶。在一些实施方案中，所述肌酐酶的冻干剂由海藻糖、金属盐和肌酐酶组成。

10、在一些实施方案中，所述金属盐中的金属离子选自亚铁离子、锰离子、镁离子、钙离子、锌离子、铜离子和钴离子。

11、在一些实施方案中，所述冻干剂在冻干前或复溶后的液体中，海藻糖的摩尔浓度是25～100mmol/l，优选50～100mmol/l，更优选50mmol/l、55mmol/l、60mmol/l、65mmol/l、70mmol/l、75mmol/l、80mmol/l、81mmol/l、82mmol/l、83mmol/l、84mmol/l、85mmol/l、86mmol/l、87mmol/l、87.64mmol/l、88mmol/l、89mmol/l、90mmol/l、91mmol/l、92mmol/l、93mmol/l、94mmol/l、95mmol/l或100mmol/l。在一些实施方案中，所述冻干剂中金属离子与海藻糖的摩尔比选自1：25～1：180，优选自1：25、1：29.2、1：30、1：31、1：32、1：33、1：34、1：35、1：36、1：37、1：38、1：39、1：40、1：41、1：42、1：43、1：43.8、1：44、1：45、1：50、1：55、1：56、1：57、1：58、1：58.4、1：59、1：60、1：65、1：70、1：75、1：80、1：81、1：82、1：83、1：84、1：85、1：86、1：87、1：87.6、1：88、1：89、1：90、1：91、1：92、1：93、1：94、1：95、1：100、1：105、1：110、1：115、1：120、1：125、1：130、1：135、1：140、1：145、1：150、1：155、1：160、1：165、1：170、1：171、1：172、1：173、1：174、1：175、1：175.2、1：176、1：177、1：178、1：179或1：180。

12、在一些实施方案中，所述冻干剂中肌酐酶与海藻糖的摩尔比选自1：150～1：900，优选自1：150、1：155、1：160、1：165、1：170、1：175、1：180、1：185、1：190、1：195、1：200、1：250、1：300、1：350、1：400、1：450、1：455、1：460、1：465、1：470、1：475、1：480、1：485、1：490、1：495、1：495.2、1：500、1：505、1：510、1：515、1：520、1：525、1：530、1：535、1：540、1：545、1：550、1：600、1：550、1：700、1：750、1：800、1：805、1：810、1：815、1：820、1：824.9、1：825、1：830、1：835、1：840、1：845、1：850或1：900。

13、在一些实施方案中，所述金属离子为锰离子。在一些实施方案中，所述锰离子是以mn2+盐的形式添加入冻干剂中，包括但不限于氯化锰、硫酸锰、硝酸锰中的一种或几种。在一些实施方案中，所述肌酐酶冻干剂中，锰离子与肌酐酶的摩尔比选自2：1～20：1，优选自2.5：1～17：1，更优选自2：1、2.82：1、3：1、4：1、5：1、5.6：1、6：1、7：1、8：1、8.45：1、9：1、10：1、11：1、11.3：1、12：1、13：1、14：1、14.2：1、15：1、16：1、16.95：1、17：1、18：1、19：1、20：1。

14、在一些实施方案中，所述金属离子为镁离子。在一些实施方案中，所述镁离子是以mg2+盐的形式添加入冻干剂中，包括但不限于氯化镁、硫酸镁中的一种或几种。在一些实施方案中，所述肌酐酶冻干剂中，镁离子与肌酐酶的摩尔比选自2：1～20：1，优选自2.5：1～17：1，更优选自2：1、2.82：1、3：1、4：1、5：1、5.6：1、6：1、7：1、8：1、8.45：1、9：1、10：1、11：1、11.3：1、12：1、13：1、14：1、14.2：1、15：1、16：1、16.95：1、17：1、18：1、19：1、20：1。

15、在一些实施方案中，所述金属离子为锌离子。在一些实施方案中，所述锌离子是以zn2+盐的形式添加入冻干剂中，包括但不限于氯化锌、硫酸锌中的一种或几种。在一些实施方案中，所述肌酐酶冻干剂中，锌离子与肌酐酶的摩尔比选自2：1～20：1，优选自2.5：1～17：1，更优选自2：1、2.82：1、3：1、4：1、5：1、5.6：1、6：1、7：1、8：1、8.45：1、9：1、10：1、11：1、11.3：1、12：1、13：1、14：1、14.2：1、15：1、16：1、16.95：1、17：1、18：1、19：1、20：1。

16、在一些实施方案中，所述金属离子为钴离子。在一些实施方案中，所述钴离子是以co2+盐的形式添加入冻干剂中，包括但不限于氯化钴、硫酸钴中的一种或几种。在一些实施方案中，所述肌酐酶冻干剂中，钴离子与肌酐酶的摩尔比选自2：1～20：1，优选自2.5：1～17：1，更优选自2：1、2.82：1、3：1、4：1、5：1、5.6：1、6：1、7：1、8：1、8.45：1、9：1、10：1、11：1、11.3：1、12：1、13：1、14：1、14.2：1、15：1、16：1、16.95：1、17：1、18：1、19：1、20：1。

17、在一些实施方案中，所述金属离子为铜离子。在一些实施方案中，所述铜离子是以cu2+盐的形式添加入冻干剂中，包括但不限于氯化铜、硫酸铜中的一种或几种。在一些实施方案中，所述肌酐酶冻干剂中，铜离子与肌酐酶的摩尔比是2：1～20：1，优选自2.5：1～17：1，更优选自2：1、2.82：1、3：1、4：1、5：1、5.6：1、6：1、7：1、8：1、8.45：1、9：1、10：1、11：1、11.3：1、12：1、13：1、14：1、14.2：1、15：1、16：1、16.95：1、17：1、18：1、19：1、20：1。

18、在一些实施方案中，所述金属离子为亚铁离子。在一些实施方案中，所述亚铁离子是以fe2+盐的形式添加入冻干剂中，包括但不限于氯化亚铁、硫酸亚铁中的一种或几种。在一些实施方案中，所述肌酐酶冻干剂中，亚铁离子与肌酐酶的摩尔比选自2：1～20：1，优选自2.5：1～17：1，更优选自2：1、2.82：1、3：1、4：1、5：1、5.6：1、6：1、7：1、8：1、8.45：1、9：1、10：1、11：1、11.3：1、12：1、13：1、14：1、14.2：1、15：1、16：1、16.95：1、17：1、18：1、19：1、20：1。

19、在一些实施方案中，所述冻干剂在冻干前或复溶后的液体中海藻糖的质量浓度是10-100g/l，优选自20g/l、30g/l、40g/l、50g/l、60g/l、70g/l、80g/l、90g/l、100g/l。在一些实施方案中，所述冻干剂在冻干前或复溶后的液体中或者冻干剂中肌酐酶与海藻糖的质量比选自1：2～1：10，优选1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10，更优选肌酐酶和海藻糖的质量比是1：6。

20、在一些实施方案中，所述冻干剂中的金属离子为锰离子。在一些实施方案中，所述锰离子是以mn2+盐的形式添加入冻干剂中，包括但不限于氯化锰、硫酸锰、硝酸锰中的一种或几种。在一些实施方案中，所述肌酐酶冻干剂中，硫酸锰与肌酐酶的质量比是0.01：1～0.2：1，优选自0.01：1、0.0169：1、0.02：1、0.03：1、0.0338：1、0.04：1、0.05：1、0.0507：1、0.06：1、0.0676：1、0.07：1、0.08：1、0.0845：1、0.09：1、0.1：1、0.1014：1、0.11：1、0.12：1、0.13：1、0.14：1、0.15：1、0.16：1、0.17：1、0.18：1、0.19：1、0.2：1，更优选硫酸锰与肌酐酶的质量比是0.0338：1。

21、在一些实施方案中，所述冻干剂中的金属离子为镁离子。在一些实施方案中，所述镁离子是以mg2+盐的形式添加入冻干剂中，包括但不限于氯化镁、硫酸镁中的一种或几种。在一些实施方案中，所述肌酐酶冻干剂中，硫酸镁与肌酐酶的质量比是0.01：1～0.2：1，优选自0.01：1、0.02：1、0.0246：1、0.03：1、0.04：1、0.0493：1、0.05：1、0.06：1、0.07：1、0.0739：1、0.08：1、0.09：1、0.0986：1、0.1：1、0.11：1、0.12：1、0.1232：1、0.13：1、0.14：1、0.1479：1、0.15：1、0.16：1、0.17：1、0.18：1、0.19：1、0.2：1，更优选硫酸镁与肌酐酶的质量比是0.0493：1。

22、在一些实施方案中，所述冻干剂中的金属离子为锌离子。在一些实施方案中，所述锌离子是以zn2+盐的形式添加入冻干剂中，包括但不限于氯化锌、硫酸锌中的一种或几种。在一些实施方案中，所述肌酐酶冻干剂中，硫酸锌与肌酐酶的质量比是0.01：1～0.2：1，优选自0.01：1、0.02：1、0.0288：1、0.03：1、0.04：1、0.05：1、0.0575：1、0.06：1、0.07：1、0.08：1、0.0863：1、0.09：1、0.1：1、0.11：1、0.115：1、0.12：1、0.13：1、0.14：1、0.144：1、0.15：1、0.16：1、0.17：1、0.173：1、0.18：1、0.19：1、0.2：1，更优选硫酸锌与肌酐酶的质量比是0.575：1。

23、在一些实施方案中，所述冻干剂中的金属离子为钴离子。在一些实施方案中，所述钴离子是以co2+盐的形式添加入冻干剂中，包括但不限于氯化钴、硫酸钴中的一种或几种。在一些实施方案中，所述肌酐酶冻干剂中，硫酸钴与肌酐酶的质量比是0.01：1～0.2：1，优选自0.01：1、0.02：1、0.0277：1、0.03：1、0.04：1、0.05：1、0.0554：1、0.06：1、0.07：1、0.08：1、0.0831：1、0.09：1、0.1：1、0.11：1、0.111：1、0.12：1、0.13：1、0.139：1、0.14：1、0.15：1、0.16：1、0.166：1、0.17：1、0.18：1、0.19：1、0.2：1，更优选硫酸钴与肌酐酶的质量比是0.554：1。

24、在一些实施方案中，所述冻干剂中的金属离子为铜离子。在一些实施方案中，所述铜离子是以cu2+盐的形式添加入冻干剂中，包括但不限于氯化铜、硫酸铜中的一种或几种。在一些实施方案中，所述肌酐酶冻干剂中，硫酸铜与肌酐酶的质量比是0.01：1～0.2：1，优选自0.01：1、0.02：1、0.025：1、0.03：1、0.04：1、0.05：1、0.06：1、0.07：1、0.075：1、0.08：1、0.09：1、0.1：1、0.11：1、0.12：1、0.125：1、0.13：1、0.14：1、0.15：1、0.16：1、0.17：1、0.18：1、0.19：1、0.2：1，更优选硫酸铜与肌酐酶的质量比是0.05：1。

25、在一些实施方案中，所述冻干剂中的金属离子为亚铁离子。在一些实施方案中，所述亚铁离子是以fe2+盐的形式添加入冻干剂中，包括但不限于氯化亚铁、硫酸亚铁中的一种或几种。在一些实施方案中，所述肌酐酶冻干剂中，硫酸亚铁与肌酐酶的质量比是0.01：1～0.2：1，优选自0.01：1、0.02：1、0.0278：1、0.03：1、0.04：1、0.05：1、0.0556：1、0.06：1、0.07：1、0.08：1、0.0834：1、0.09：1、0.1：1、0.11：1、0.1112：1、0.12：1、0.13：1、0.139：1、0.14：1、0.15：1、0.16：1、0.1668：1、0.17：1、0.18：1、0.19：1、0.2：1，更优选硫酸亚铁与肌酐酶的质量比是0.0556：1。

26、在一些实施方案中，所述肌酐酶冻干剂中的肌酐酶选自seq id no：1、seq id no：3或seq id no：5所示的肌酐酶。在一些实施方案中，所述肌酐酶冻干剂中的肌酐酶为seqid no：5所示的肌酐酶。

27、一方面，本技术提供了海藻糖与金属盐的组合在制备肌酐酶冻干剂中的应用。

28、在一些实施方案中，所述金属盐中的金属离子选自亚铁离子、锰离子、镁离子、钙离子、锌离子、铜离子和钴离子。在一些实施方案中，所述金属离子和海藻糖的摩尔比选自1：25～1：180，优选自1：25、1：29.2、1：30、1：31、1：32、1：33、1：34、1：35、1：36、1：37、1：38、1：39、1：40、1：41、1：42、1：43、1：43.8、1：44、1：45、1：50、1：55、1：56、1：57、1：58、1：58.4、1：59、1：60、1：65、1：70、1：75、1：80、1：81、1：82、1：83、1：84、1：85、1：86、1：87、1：87.6、1：88、1：89、1：90、1：91、1：92、1：93、1：94、1：95、1：100、1：105、1：110、1：115、1：120、1：125、1：130、1：135、1：140、1：145、1：150、1：155、1：160、1：165、1：170、1：171、1：172、1：173、1：174、1：175、1：175.2、1：176、1：177、1：178、1：179或1：180。更优选金属离子和海藻糖的摩尔比是1：87.6。

29、在一些实施方案中，所述肌酐酶冻干剂中的肌酐酶选自seq id no：1、seq id no：3或seq id no：5所示的肌酐酶。在一些实施方案中，所述肌酐酶冻干剂中的肌酐酶为seqid no：5所示的肌酐酶。

30、在一种实施方式中，所述肌酐酶冻干剂按如下方法制备：(1)配制肌酐酶和如上所述的海藻糖、金属盐的混合物，使溶液体系中肌酐酶浓度为3-6mg/ml，优选4-6mg/ml，更优选5mg/ml；海藻糖浓度为1-5％(m/v)，优选2-4％(m/v)，优选3％(m/v)，金属离子浓度为0.5mm-3mm，优选0.5mm-2.5mm，最优选0.5-1.5mm，(2)将步骤(1)配制的混合物冻干。在一些实施方案中，所述冻干包括混合物在-80℃冷冻过夜，使用冷冻干燥机在-65℃条件下真空干燥16h得到冻干制剂。

31、在一些实施方案中，所述金属离子选自铁离子、锰离子、镁离子、钙离子、锌离子、铜离子和钴离子。在一些实施方案中，所述金属离子为锰离子。

32、在一些实施方案中，所述肌酐酶选自seq id no：1、seq id no：3或seq id no：5所示的肌酐酶。在一些实施方案中，所述肌酐酶为seq id no：5所示的肌酐酶。

33、野生型和突变体的氨基酸序列见seq id no：1、3和5：

34、msksvfvgeltwkeyearvaagdcvlmlpvgaleqhghhmcmnvdvllptavcqrvaerigalvlpglqygyksqqksgggnhfpgttsldgatltgtvqdiirelarhgvrrlvlmnghyensmfivegidlalrelryagihdfkvvvlsywdfvkdpaviqrlypegflgwdiehggvfetslmlalypdlvdlervvdhppatfppydvfpvdpartpapgtlssaktasrekgelilevcvqgiadaigqefppt(seq id no：1)

35、msksvfvgeltwkeyearvaagdcvlmlpvgaleqhghhmcmnvdvllptavckrvaerigalvmpglqygyksqqksgggnhfpgttsldgatltgtvqdiirelarhgarrlvlmnghyensmfivegidlalrelryagiqdfkvvvlsywdfvkdpaviqqlypegflgwdiehggvfetslmlalypdlvdldrvvdhppatfppydvfpvdpartpapgtlssaktasrekgelilevcvqgiadaireefppt(seq id no：3)

36、msksvfvgeltwkeyearvaagdcvlmlpvgaleqhghhmcmnvdvllptavcqrvaerigalvlpglqygyksqqksgggnhfpgttsldgatltgtvqdiirelarhgvrrlvlmnghyensmfivegidlalrelryagitdfkvvvlsywdfvkdpaviqelypegflgwdiehggvfetslmlalypdlvdltrvvdhppatfppydvfpvdpartpapgtlssaktasrekgelilevcvqgiadaigqefppt(seq id no：5)

37、野生型和突变体的核苷酸序列见seq id no：2、4和6：

38、atgagcaaatccgtttttgttggcgaactgacttggaaagaatacgaagcgcgcgttgcagctggtgattgcgttctgatgctgccagtaggcgctctggagcagcacggccatcatatgtgtatgaacgttgacgtgctgctgccaacggcggtttgtcagcgtgtggccgaacgtatcggcgctctggttctgccgggcctgcagtatggctataaaagccagcagaaaagcggcggcggcaatcatttcccgggcactaccagcctggacggtgccactctgactggtactgtgcaagacattatccgtgaactggctcgtcacggtgttcgccgcctggtcctgatgaacggccactacgagaactctatgttcatcgtcgaaggtatcgatctggctctgcgtgaactgcgttacgcgggcatccatgacttcaaggtggtggttctgtcttactgggattttgtgaaagatccggcggtcatccagcgtctgtacccagaaggtttcctgggttgggatatcgaacacggcggtgtcttcgagacctctctgatgctggccctgtatccggatctggtggatctggaacgcgtagtggaccatccgccggctacgttcccgccgtacgacgtttttccggtggatccagctcgtacccctgctccaggcaccctgtcttctgccaaaactgcttcccgtgaaaaaggcgaactgatcctggaagtttgcgttcagggtatcgctgatgctattggtcaggaattcccgccgacgtaa(seq id no：2)

39、atgagcaaatccgttttcgttggcgaactgacctggaaagaatacgaagcgcgtgttgcggctggtgattgtgtgctgatgctgccggtaggtgctctggaacagcatggtcaccacatgtgtatgaacgtagacgtactgctgccaactgcggtgtgtaaacgtgtggctgaacgcatcggcgcgctggttatgccaggtctgcagtatggctacaaatctcagcagaagtctggtggcggtaaccatttcccgggtactacctctctggacggtgcgactctgaccggcaccgttcaggatatcattcgtgaactggcacgtcacggcgcacgtcgcctggttctgatgaatggtcactacgaaaacagcatgttcatcgttgagggtatcgacctggcgctgcgtgaactgcgctacgcgggtatccaggacttcaaagtggtggtgctgagctactgggacttcgtaaaagatccggctgtgattcagcagctgtacccggaaggcttcctgggttgggacattgaacacggtggtgtgttcgaaacctctctgatgctggctctgtacccggacctggttgacctggaccgcgtagttgatcatccgccggcgaccttccctccgtacgatgtgtttccggttgatccggctcgtaccccagcaccgggcactctgagctctgcaaaaaccgccagccgcgaaaagggcgaactgattctggaagtttgcgtacagggtatcgctgatgcgatccgtgaagaattcccaccgacc(seq id no：4)

40、atgagcaaatctgtttttgttggcgagctgacctggaaagaatacgaggcgcgtgtggcggccggtgattgcgtgctgatgctgccggtaggtgctctggaacagcatggccaccacatgtgcatgaatgtcgacgttctgctgccaaccgcagtttgtcaacgtgtggctgaacgcattggtgcgctggtactgcctggcctgcagtacggttacaaatcccagcagaagagcggtggtggcaaccacttcccgggcactacttccctggatggcgcaaccctgaccggtaccgttcaggatattattcgtgaactggcgcgtcatggcgtgcgtcgcctggttctgatgaacggtcactacgagaactctatgttcatcgttgagggtatcgatctggcactgcgtgaactgcgttatgcgggtatcactgacttcaaggtcgtggtactgagctactgggacttcgttaaggacccagctgttatccaggagctgtatccggaaggctttctgggttgggatatcgagcacggtggcgtgttcgagaccagcctgatgctggcgctgtatccagacctggttgacctgacccgtgttgtggaccacccgccagctaccttccctccgtatgatgtgttcccggtagatccggctcgtacgcctgcgccgggtactctgagctccgctaaaaccgcatcccgtgaaaaaggtgaactgatcctggaagtctgtgtgcagggcatcgccgatgcgattggccaggagtttccgccgacg(seq id no：6)

41、本技术的有益效果

42、本技术提供了一种肌酐酶的突变体，采用基因工程菌发酵的方案生产肌酐酶，还提供一种包含金属离子的冻干保护剂，减少肌酐酶活性在冻干过程中的损伤，具有产量高、活性好、便于运输和工业化生产的优点。