共表达PD-1-IL-7R嵌合受体的嵌合抗原受体T细胞及其用途的制作方法

本发明属于细胞培育，具体涉及共表达pd-1-il-7r嵌合受体的嵌合抗原受体t细胞及其用途。

背景技术：

1、嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)是经过工程改造的合成受体，其功能是重定向淋巴细胞以识别并清除表达特定靶抗原的细胞，最常见的是嵌合抗原受体t细胞(car t)。car上表达的特异性识别域能够与肿瘤细胞表面高表达的靶抗原有效地结合，一定程度上避开了肿瘤下调mhci的免疫逃逸，从而激活t细胞并引起有效的抗肿瘤反应。car t细胞疗法具有革命性意义，因为它在多项血液瘤临床研究中表现出了有效且迅速的抗肿瘤效果。然而，car t细胞疗法仍面临着一些局限性与挑战，包括car t细胞在实体瘤中免疫抑制微环境导致的有限的疗效、体内存活时间与发挥作用的时间有限等。因此，通过寻找一个合适的靶向分子与共刺激分子，优化car的结构，得到一种更有效的、可以作用于实体瘤的car t尤为重要。

2、pd-1，也称为cd279，一般表达在活化的t细胞、nk细胞和b细胞、巨噬细胞、dc细胞和单核细胞上，是适应性和先天性免疫反应的抑制性分子。pd-1在免疫反应中的作用是一把“双刃剑”。一方面，它可以抑制免疫细胞的过度活化，防止自体免疫杀伤的发生，以及维持机体的免疫耐受。但是另一方面，部分恶性肿瘤细胞会上调表达pd-1的配体pd-l1，并与抗肿瘤细胞结合，通过pd-1/pd-l1通路干扰保护性免疫反应，导致恶性细胞扩张。

3、il-7受体由两个跨膜成分组成——cd132和cd127。尽管在细胞表面独立表达，但这两个亚基都是il-7信号转导所必需的。cd127(il-7rα)对il-7具有特异性。有研究表明，在肿瘤环境中，t细胞上的il-7r显著下调，造成了t细胞对于il-7信号的响应弱，同时如上文所述，il-7表达也处于较低水平，故造成在肿瘤微环境中，t细胞无法响应il-7信号，由此导致其抗肿瘤功能受损。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供共表达pd-1-il-7r嵌合受体的嵌合抗原受体t细胞，能够提高car t细胞的增殖能力，增强其杀伤活性，同时记忆性t细胞的比例明显上调，其可能具有更强且长期抗肿瘤的能力。

2、本发明采取的技术方案具体如下：

3、共表达pd-1-il-7r嵌合受体的嵌合抗原受体t细胞，所述t细胞的制备方法包括以下步骤：

4、s1：phage-nkg2d-car和phage-pd-1/il-7r-nkg2d-car载体的构建；

5、所述s1中，载体的构建方式如下：

6、设计嵌合受体序列：在国家生物技术信息中心网站中查找到programmed celldeath 1与interleukin 7receptor的基因序列；将pd-1的信号肽序列、胞外区序列与il-7rα链的跨膜区、胞内区序列相连；

7、构建质粒phage-nkg2d-car和phage-pd-1/il-7r-nkg2d-car：将得到的嵌合受体序列进行合成，并连接在空载质粒phage上，通过限制性内切酶mlui与sali将phage-pd-1/il-7r-nkg2d-car酶切后，将pcr过的nkg2d-car用t4连接酶连接，得到phage-nkg2d-car。

8、其中，car主要由抗原识别域、共刺激分子域、信号转导域构成；通常通过基因工程技术将上述组件组合到一起，并转导到患者的t细胞中，使这些t细胞具备识别和杀伤特定肿瘤细胞的能力。这种car-t细胞具有高度特异性，可以在体内识别和攻击表达目标抗原的肿瘤细胞；

9、s2：phage-nkg2d-car和phage-pd-1/il-7r-nkg2d-car慢病毒的包装；

10、其中，包括质粒转染、病毒收集和浓缩、病毒滴度测定；

11、所述s2中，质粒转染采用以下步骤：

12、a1：将质粒pei、opti-mem培养基置于室温5min；

13、a2：取opti-mem 436μl于1.5mlep管中，再加入64μg pei混匀，室温静置5min；

14、a3：取12μg载体质粒，8μg pspa×2、4μg pmd2.g，加入opti-mem至500μl，室温静置5min；

15、a4：将配好的pei-opti-mem溶液加入含质粒的opti-mem中，室温静置20min；

16、a5：将1ml dna/pei混合物慢慢滴入前一天铺好的293t培养皿中，轻轻混匀，置于37℃培养箱孵育6-8h或过夜；

17、a6：更换新鲜培养基，放入37℃培养箱继续孵育。

18、所述s2中，病毒收集和浓缩采用以下步骤：

19、b1：质粒转染48h后，收集上清液后，添加10ml新鲜培养基继续培养至72h，再次收集上清液，与48h收集的上清液混合后，置于4℃冰箱内待用；

20、b2：取4℃上清液4000g离心10min，除去细胞碎片；

21、b3：以0.45μm滤器过滤得到上清液；

22、b4：将过滤后的病毒上清液转入超速离心管中，25000转离心2h，用1/100上清液体积的pbs进行稀释，反复吹打后转入密闭的离心管中4℃过夜；

23、b5：将病毒液根据体积分装，置于-80℃中保存，并取200μl病毒进行滴度测定。

24、所述s2中，病毒滴度测定采用以下步骤：

25、c1：消化293t细胞，离心后计数，用含血清培养基制成细胞悬液，调整细胞密度为4×105/ml，向24孔培养板的每孔中加入0.5ml细胞悬液；

26、c2：用全培养基按以下比例稀释病毒上清：1：3；1：9；1：27；

27、c3：分别将100μl病毒原液及按不同比例稀释后的病毒液，加入到已接种细胞的24孔板中；

28、c4：16h后弃去感染上清，添加0.5ml新鲜全培养基；

29、c5：48h后流式检测被感染细胞目的基因表达；

30、c6：计算滴度，滴度＝2*106*感染效率*稀释倍数；其结果如下：病毒收集浓缩后，经滴度检测，phage-nkg2d-car和phage-pd-1/il-7r-nkg2d-car两种病毒的滴度均为5×107tu/ml。

31、s3：测定phage-nkg2d-car和phage-pd-1/il-7r-nkg2d-car慢病毒感染t细胞阳性率；

32、所述s3中的测定方法如下，将pbmc刺激后分化的t细胞接种于6孔板中,每孔2×106个细胞，且分为3组：无病毒感染阴性对照组、phage-nkg2d-car和phage-pd-1/il-7r-nkg2d-car，每组各2孔；

33、实验组分别按照moi＝10:1加入相应体积的病毒，12h后更换新鲜的培养液，继续培养48h，使用流式检测nkg2d与pd-1的表达，得到nkg2d-car t细胞的nkg2d阳性率为77％，pd-1/il-7r-nkg2d-car t阳性率为76％。

34、s4：实施pd-1/il-7r的表达用于促进car t对肿瘤杀伤效率的验证实验；

35、所述s4中的验证方法如下：

36、首先，将panc-1、capan-2细胞与car t细胞的混合培养；

37、其中，将nkg2d-car t和pd-1/il-7r-nkg2d-car t分别与cfse标记的panc-1、capan-2两种靶细胞共培养，方法如下：

38、s41：在共孵育的孔中加入10μlcfse标记的panc-1细胞，分别向对应的孔中加入10、30、90μl的t、nkg2d-car t、pd-1/il-7r-nkg2d-car t细胞，不考虑复孔的前提下共9组，在孔板盖子上做好标记，保证效靶比分别1：1、3：1、9：1；

39、s42：每个孔中根据所加体积，分别补充x-vivo基础培养基为180μl、160μl、100μl，吹打混匀后放置于培养箱中，37℃静置培养16h；

40、s43：另做一组只有cfse标记的肿瘤细胞作为自凋亡对照，每个效靶比/效应细胞的样品做三个复孔；

41、s44：16h后，取出培养板，将细胞收集到1.5mlep管中，使用1ml1xpbs洗涤两次；向洗涤离心后的细胞沉淀中加入100μl facs，吹起细胞沉淀并持续吹打至细胞分布均匀，向实验组ep管中加入0.3μl apc humanannexinv抗体，将染色液轻轻混匀，在避光条件下，室温染色15min，染色结束后使用facs将体积补至250μl，将细胞悬液通过滤网过滤掉细胞残渣，滤液转移至流式管中，通过流式细胞仪进行荧光通路检测；

42、然后，进行杀伤效率分析：流式细胞仪上选定annexinⅴ+的类群，得到被t细胞杀伤的肿瘤细胞比例，评估t细胞对肿瘤细胞的细胞毒性，根据流式结果，pd-1/il-7r-nkg2d-car t细胞对panc-1和capan-2细胞的杀伤效果比nkg2d-car t细胞明显。

43、s5：实施pd-1/il-7r的表达用于促进car t记忆的验证实验；

44、所述s5中的验证方法如下，首先，采用panc-1、capan-2细胞与car t细胞的混合培养：

45、其中，取nkg2d-car t、pd-1/il-7r-nkg2d-car t各5×105个细胞至24孔板的三个孔中，每组做三个复孔，向对应的每个孔加入1.6×105个panc-1细胞，保证e：t约为3:1，将培养体积补充至500μl，置于37℃恒温培养箱进行培养；

46、3h后收集细胞悬液，每次加入1ml facs进行洗涤，重复洗涤一次，向洗涤离心后的沉淀中加入0.3μl cd3、cd45ra、cd62l抗体，用移液枪多次吹打，在避光条件下，室温染色15min，使用1ml facs进行洗涤一次，向洗涤离心后的沉淀中加入300μl facs洗液重悬细胞，将细胞悬液通过滤网过滤掉细胞残渣，将滤液转移至流式管中，通过流式细胞仪进行荧光通路检测。

47、s6：实施pd-1/il-7r的表达用于促进car t抗肿瘤的验证实验。

48、所述s6中的验证方法如下，采用nsg小鼠进行抗肿瘤实验，其步骤如下：

49、s61：构建nsg小鼠car t治疗模型，确定雌性nsg小鼠饲养状态，并采用剃毛刀将小鼠背部一侧的毛清理干净；

50、s62：制备并扩增luciferase病毒感染标记的panc-1细胞，将胰酶消化panc-1细胞并离心后，用pbs重悬细胞，血球计数板计数后，将细胞的密度调整为2×107个/ml，每管加入1/2体积的基质胶混匀后，将细胞放置在冰上；

51、s63：按照注射200μl/只的规格，给小鼠进行皮下荷瘤，荷瘤一周内观察小鼠注射部位的肿瘤生长，每3天使用游标卡尺测量并计算肿瘤的体积；

52、s64：肿瘤生长期间采用car对应的慢病毒浓缩液按照moi＝10的比例感染t细胞，加入病毒24h后换液，继续培养3天，得到治疗所用的car t细胞，对car t细胞进行计数，根据计数结果调整密度至5×107/ml，将细胞放置于冰上；

53、s64：按照100μl/只的规格对小鼠进行尾静脉注射car-t细胞，注射car t细胞后，每隔3天测量肿瘤体积，每周对小鼠进行ivis成像；

54、s64：nsg小鼠抗肿瘤实验结果：mock t组肿瘤生长最快，nkg2d-car t组肿瘤生长相对较慢，pd-1/il-7r-nkg2d-car t组肿瘤减小。

55、共表达pd-1-il-7r嵌合受体的嵌合抗原受体t细胞的用途，用于增强car t细胞的增殖能力，应用于肿瘤治疗中。

56、本发明取得的技术效果为：

57、本发明的共表达pd-1-il-7r嵌合受体的嵌合抗原受体t细胞采用嵌合受体的思路，首次将pd-1的胞外域与il-7r的跨膜区及胞内域相结合，既可以逆转pd-1/pd-l1的抑制性信号为il-7的激活性信号，也可以竞争性结合肿瘤细胞的pd-l1，以解除pd-1/pd-l1对t细胞的抑制作用；由此提高car t细胞的增殖能力，增强其杀伤活性，同时记忆性t细胞的比例明显上调，提示其可能具有更强且长期抗肿瘤的能力。