一种多层屏障仿生芯片及其应用和集成系统

本发明涉及器官及/或细胞培养的芯片领域，具体涉及一种多层屏障仿生芯片及其应用和集成系统。

背景技术：

1、常规的生命科学研究的模型，主要基于动物和二维(2d)细胞。虽然动物模型已经成就了人类对丰富的生理和疾病的理解并开发了新药物，但动物模型作为对人类研究的模型，存在很多局限性，比如候选药物可能会因为在动物身上缺乏疗效，或者在动物身上发现可能与人类无关的危险或毒性而被终止。尽管在过去20年里，体外生物学和毒理学取得了重大进展，但目前超过80％的研究药物在临床试验中失败，其中60％是由于缺乏疗效，另外30％是由于毒性。2d细胞培养已用于生命科学研究长达一个多世纪。但是，这种培养方式难以支持多种细胞类型的组织特异性分化功能，也难以提供有关生命系统复杂性的信息。因此迫切需要针对能够更加真实反应复杂人体特征的体外建模和测试平台。事实上，随着精细加工技术的迅速发展，可以在小型系统中进行台式实验，促进了微流控芯片技术的发展。器官芯片是3d微流控细胞培养装置，依托于这项技术，并通过结合干细胞诱导分化技术、组织工程技术等，可以构建出器官生理微系统,可在体外模拟人体不同组织器官的主要结构功能和复杂的器官间联系。人体器官芯片技术正不断获得研究者的青睐，在未来可能取代动物实验，成为一种颇具前景的研究手段。

2、现阶段，大多数器官芯片的研究局限于对单独的器官功能(或功能界面)进行体外建模，这忽略了器官/组织-器官屏障的相互关系，事实上。器官正常生理运转需要体液、血液流通所实现的物质代谢，物质在体内的消化、吸收、运转、分解、代谢等与生理有关的化学过程。此外，现阶段大多数分析基于片外和成像技术，而这导致器官芯片的操作必须配合繁杂的应用工具。新型先进的多器官芯片系统由于其对药物效果的建模还原度的评估，在药物研究的发展中一直具有显着趋势，但会进一步加大操作分析的难度。随着微流控技术的进步，在芯片上或基于芯片的复杂体系的微流体驱动与控制具备了替代传统大型商用设备，更利于集成系统的构建。而与传统技术相比，生物传感器为与组织工程相关的诊断和治疗应用提供了灵敏、选择性、现场和实时的微生物生理信号监测，这极大地开拓了器官芯片的应用场景。

技术实现思路

1、为了克服现有技术上的问题，本发明提供了一种多层屏障仿生芯片及其应用和集成系统。本发明通过结构设计，实现对目标器官-器官屏障进行体外建模，为将该体外建模的设计，并结合控制芯片模块，检测芯片模块及相关配套设备，实现集成化一体化的器官培养，生物医学检测，在线流体驱动与控制，原位观察的平台。

2、本发明提供以下技术方案：

3、一种多层屏障仿生芯片，从下至上依次包括微通道层、多孔膜层、上腔室层和顶盖层，其特征在于，微通道层与上腔室共用流体空间并提供下层细胞培养的空间，在多孔膜层、上腔室层上设有通孔与微通道连通，所述多孔膜层设有孔径为8-15μm的多孔膜，所述上腔室层设有若干细胞培养腔室，细胞培养腔室的底部为多孔膜层的多孔膜，所述顶盖层对上腔室层进行封盖，并对上腔室层的通孔进行密封，在所述微通道层与上腔室层分别培养模拟关键功能界面内侧和外侧的细胞。

4、进一步的，所述微通道层为玻璃材质，微通道高度不低于40μm，长度与芯片的上腔室层相对应，所述多孔膜层由下部的聚二甲基硅氧烷pdms孔板和上部的玻璃孔板夹持多孔膜，多孔膜材质为聚碳酸酯膜，所述上腔室层和顶盖层为聚甲基丙烯酸甲酯pmma材质。

5、进一步的，在所述顶盖层与培养腔室对应位置设有培养基灌流接头，通过液体驱动装置对培养腔室内进行液体灌流。

6、进一步的，在所述微通道层中培养u87人脑星形胶质母细胞瘤细胞，在所述上腔室层中第一培养腔室培养hcmec/d3人脑微血管内皮细胞，在第二培养腔室中培养sh-sy5y神经母细胞瘤细胞，在第三培养腔室中培养hcmec/d3人脑微血管内皮细胞。

7、一种利用多层屏障仿生芯片构建神经-外周免疫相互作用模型的方法，包括以下步骤：

8、步骤1)将芯片各结构进行灭菌，通过上腔室层的通孔向微通道层接种u87细胞，并用培养基灌满微通道层及上腔室层，用顶盖层盖住芯片，夹紧顶盖层与芯片倒置培养，直至u87细胞在多孔膜层的pdms孔板侧的多孔膜上完成贴壁；

9、步骤2)将芯片正面放置，弃掉培养基，向上腔室层的第一细胞培养腔室、第二细胞培养腔室和第三细胞培养腔室分别接种hcmec/d3细胞、sh-sy5y细胞、hcmec/d3细胞，待细胞贴壁后，对第一、第三细胞培养腔室进行细胞灌流培养，灌流速度为500μl/h，待hcmec/d3细胞形成致密的结构；

10、步骤3)向上腔室层的第一细胞培养腔室中接种个数为thp-1人单核细胞白血病细胞。

11、进一步的：其中u87细胞、sh-sy5y细胞、hcmec/d3细胞和thp-1细胞的细胞接种个数比为(3～10)：1：(5～20)：(3～10)。

12、一种器官芯片集成系统，包括器官芯片模块、液路控制模块及检测芯片模块，

13、所述器官芯片模块将权利要求3所述多层屏障仿生芯片放置在壳体内，向壳体里连通温控风扇及co2供给装置，所述上腔室层的第一培养腔室和第三培养腔室所设灌流接头的进液液路连接注射泵，出液液路分别连接第一、第三储液装置；

14、所述液路控制模块的液路控制芯片上游连接第一、第三储液装置的出液管路以及检测储备液的出液管路，下游连接检测芯片的进液管路，液路控制芯片由注射泵和气体供给装置完成液体通路的切换；

15、所述检测芯片模块将检测芯片放置在载物台上，载物台下设有led-滤光底座，载物台上放置小型显微镜，在载物台外设有避光外壳，在避光外壳上设有观测区，观测区对应小型显微镜的目镜，检测芯片由若干反应腔室串联，每个反应腔室分别连接进液管路、功能化载体进液口和出液管道，出液管道连接储液装置。

16、进一步的，所述液路控制芯片由下至上依次为基底层、pdms缓冲层、气仓层和液道层，所述液道层为若干相互连通液体支路，气仓层设有若干气体控制单元，每个液体支路对应一个气体控制单元，气体控制单元发生气仓形变控制液体支路的通断，气体供给装置由压力控制阀将储气瓶中的气体通入气仓层，电磁阀控制气路的切换。

17、进一步的，所述检测储备液分别装有缓冲液，一级hcr扩增探针与二级hcr引发探针储备液，二级hcr扩增荧光探针储备液，检测储备液由四通管接入液路控制芯片。

18、进一步的，所述检测芯片的进液管路通入第一、第三储液装置流出的培养液以及检测储备液体，在反应腔室中包埋若干功能化水凝胶颗粒，检测芯片的进液管路的孔径小于功能化水凝胶颗粒的粒径。

19、采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：

20、(1)本发明的屏障仿生芯片可以实现多细胞共培养的体外建模，模拟细胞所需的复杂而动态的微环境，实现可静态或动态的多单元多细胞多类型的细胞共培养，提供细胞间相互作用研究的有效，可重复使用，多元化通用平台。

21、(2)本发明的屏障仿生芯片简化了操作，减少了污染风险，降低了对操作人员和复杂仪器的要求。实验可以快速完成，让细胞回到稳定和适宜的生长环境。

22、(3)本发明的屏障仿生芯片可以提供多种材料(pmma,pdms,玻璃)的紧密加工方法，这为针对不同材料特性的芯片设计应用提供了具体的技术方法。

23、(4)本发明的屏障仿生芯片系统不仅能够应用于复杂器官或多器官体外的疾病建模、药物研发、个性化医疗等不同的科学研究，还可以应用于特殊环境如深海、空间环境、高温高压、强光强辐射环境的生命科学研究，并提供了可行的技术支撑。

24、(5)本发明的屏障仿生芯片系统中的检测方法，创新结合了功能化水凝胶作为固相载体，结合微流控芯片技术，可以在芯片上提供多种识别/捕获生物标志物的探针结合点和方法，这将为及时检测技术提供更多可能性。

25、(6)本发明的屏障仿生芯片系统中检测方法的两级hcr方法设计，第二级hcr探针设计为通用的，只需要根据靶标设计一级hcr探针即可实现两级hcr的扩增，并将靶标浓度通过第二级hcr的荧光报告分子转换为荧光信号。