一种检测H3F3A基因突变的引物探针和试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及基因突变分子检测的，具体地，涉及一种检测h3f3a基因突变的引物探针和试剂盒及其应用。

背景技术：

1、2021年版who中枢神经系统肿瘤分类将脑胶质瘤分为1～4级，1、2级为低级别脑胶质瘤，3、4级为高级别脑胶质瘤。脑胶质瘤确诊需要通过肿瘤切除手术或活检手术获取标本，进行组织病理和分子病理整合诊断，确定病理分级和分子亚型。whoⅱ级肿瘤病人的中位生存期超过5年，ⅲ级为2-3年，ⅳ级为14.6个月。分子标志物，如h3f3a、tert基因、idh1基因等对脑胶质瘤的分类、分型、分级、预后和治疗具有重要意义。

2、h3f3a基因(又称h3.3或h3-3a)属于组蛋白基因家族，h3f3a基因常见的突变类型是h3f3a p.k28m(k27m)、p.g35r/v(g34r/g34v)，分别是诊断弥漫性中线胶质瘤和弥漫性大脑半球胶质瘤的关键参考指标。

3、h3f3a基因突变检测对于中枢神经肿瘤的临床管理有重要意义，已被纳入多项临床诊疗指南，如《2021年who中枢神经系统肿瘤分类概述》、《2016nccn肿瘤临床实践指南：中枢神经系统肿瘤》及《脑胶质瘤诊疗指南(2022年版)》。

4、目前h3f3a基因突变检测的方法主要为qpcr法。现有技术cn105734137a采用锁核酸lna修饰的引物探针进行检测，但lna修饰的方式检测成本较高，对低突变频率的突变检测效果不好。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是现有技术中存在的上述缺陷与不足，提供一种检测h3f3a基因突变的引物探针和试剂盒及其应用。

2、本发明的第一个目的是提供一种用于检测h3f3a基因突变的通用下游引物。

3、本发明的第二个目的是提供一种用于检测h3f3a基因突变的通用荧光探针。

4、本发明的第三个目的是提供一种用于检测h3f3a基因突变的组合物。

5、本发明的第四个目的是提供上述的通用下游引物、通用荧光探针和/或组合物在制备检测h3f3a基因突变产品中的应用。

6、本发明的第五个目的是提供一种检测h3f3a基因突变的试剂盒。

7、本发明的第六个目的是提供一种检测h3f3a基因突变的反应体系。

8、为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

9、一种用于检测h3f3a基因突变的通用下游引物，所述通用下游引物的核苷酸序列如seq id no:2所示，所述h3f3a基因突变为h3f3a k27m、h3f3ag34r和h3f3a g34v突变。

10、一种用于检测h3f3a基因突变的通用荧光探针，所述通用荧光探针的核苷酸序列如seq id no:3所示，所述h3f3a基因突变为h3f3a k27m、h3f3ag34r和h3f3a g34v突变。

11、优选地，所述通用荧光探针的5'端标记荧光基团，3'端标记淬灭基团。

12、作为一种可实施的方式，所述通用荧光探针的5'端标记fam，3'端标记mgb。

13、一种用于检测h3f3a基因突变的组合物，所述组合物包含上述的通用下游引物和通用荧光探针，所述h3f3a基因突变为h3f3a k27m、h3f3a g34r和h3f3a g34v突变。

14、优选地，所述组合物还包含核苷酸序列如seq id no:1、核苷酸序列如seq id no:7和核苷酸序列如seq id no:8的上游引物中的一种或几种。

15、更优选地，核苷酸序列如seq id no:1的上游引物用于检测h3f3a k27m基因突变，核苷酸序列如seq id no:7的上游引物用于检测h3f3a g34r基因突变，核苷酸序列如seqid no:8的上游引物用于检测h3f3a g34v基因突变。

16、更优选地，所述组合物还包含核苷酸序列如seq id no:4和seq id no:5所示的内参基因引物和核苷酸序列如seq id no:6所示的内参基因探针。

17、更优选地，所述内参基因探针的5'端标记荧光基团，3'端标记淬灭基团。

18、作为一种可实施的方式，所述内参基因探针的5'端标记vic，3'端标记mgb。

19、上述的通用下游引物、通用荧光探针和/或组合物在制备检测h3f3a基因突变产品中的应用，所述h3f3a基因突变为h3f3a k27m、h3f3a g34r和h3f3ag34v突变。

20、一种检测h3f3a基因突变的试剂盒，所述试剂盒包含上述的通用下游引物和/或通用荧光探针，所述h3f3a基因突变为h3f3a k27m、h3f3a g34r和h3f3a g34v突变。

21、优选地，所述试剂盒还包含核苷酸序列如seq id no:1、核苷酸序列如seq id no:7和核苷酸序列如seq id no:8的上游引物中的一种或几种。

22、优选地，所述试剂盒还包含核苷酸序列如seq id no:4和seq id no:5所示的内参基因引物、核苷酸序列如seq id no:6所示的内参基因探针、10×反应缓冲液、dntps、taqdna聚合酶、阳性对照参考品和/或阴性对照参考品。

23、更优选地，所述阳性对照参考品为h3f3a k27m、h3f3a g34r和h3f3ag34v基因突变频率分别为5％、2％、1％、0.5％、0％的标准品。

24、更优选地，所述阴性对照参考品为灭菌超纯水。

25、一种检测h3f3a基因突变的反应体系，所述反应体系中，上游引物和通用下游引物的浓度分别为0.1～0.4μm，通用荧光探针的浓度为0.1～0.4μm，内参基因引物的浓度为0.05～0.2μm，内参基因探针的浓度为0.02～0.08μm，10×反应缓冲液4.8～5.2μl，dntps0.1～0.3mm，taq dna聚合酶2～3u，待检样品4～6ng/μl，加无rna酶的去离子水至50μl。

26、更优选地，所述反应体系为：上游引物和通用下游引物的浓度分别为0.2μm，通用荧光探针的浓度为0.2μm，内参基因引物的浓度为0.1μm，内参基因探针的浓度为0.05μm，10×反应缓冲液5μl，dntps 0.2mm，taq dna聚合酶2.5u，待检样品5ng/μl，加无rna酶的去离子水至50μl。

27、优选地，所述反应体系的反应条件为95℃30s；95℃20s、65℃30s，10个循环；95℃20s、60℃30s，35个循环。

28、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

29、本发明提供的一种检测h3f3a基因突变的引物探针和试剂盒，可对h3f3a基因中常见的突变类型h3f3a k27m、h3f3a g34r和h3f3a g34v进行检测，具有灵敏度高、操作便捷快速和成本较低等优点。

30、(1)灵敏度高：对于含有h3f3a k27m基因突变的样本，可以检测到k27m基因突变频率为0.5％的样本；对于含有h3f3a g34r基因突变的样本，可以检测到g34r基因突变频率为0.5％的样本；对于含有h3f3a g34v基因突变的样本，可以检测到g34v基因突变频率为0.5％的样本。

31、(2)操作便捷：操作步骤简单，可直接检测h3f3a基因突变，通过观察扩增曲线直接判断阴性和阳性，结果直接客观，不需要繁琐的电泳等其他任何分析步骤，对操作人员的经验要求不高。

32、(3)成本较低：相比于cn105734137a采用检测成本较高的锁核酸lna修饰的引物探针进行检测，本发明提供了一种经济、简单的引物探针和试剂盒进行h3f3a基因突变检测。