一种与绵羊尾脂沉积相关的分子标记、检测方法和应用

本发明属于分子标记及其应用，具体涉及一种与绵羊尾脂沉积相关的分子标记、其检测方法及应用。

背景技术：

1、nr1h4基因也被称为核受体亚家族1，组h，成员4(nuclear receptor subfamily1，group h，member 4)或法尼醇x受体(farnesoid x receptor，简称fxr，fxrα，或nr1h4/far)。它是核受体超家族的一部分，并且主要在回肠中表达。该受体是一种g蛋白偶联受体，能与胆汁酸结合。胆汁酸是由肝脏产生的胆固醇代谢物，并通过门静脉到达小肠以帮助消化和吸收脂溶性物质。在小肠中，胆汁酸被重新吸收回门静脉并最终返回到肝脏以完成所谓的肠肝循环。核受体fxr是胆汁酸在肠肝循环中的主要传感器，其通过抑制胆固醇7α-羟化酶(cyp7a1)来负反馈调节胆汁酸合成。此外，fxr通过调节参与糖异生、脂质代谢、肠道炎症和肠道屏障功能的基因来影响葡萄糖稳态和能量稳态。fxr的激活通过上调成纤维细胞生长因子19(fgf19)来抑制糖异生。在回肠中，胆汁酸激活fxr会导致fgf19分泌进入门静脉血，最终到达肝脏，在那里它结合并激活成纤维细胞生长因子受体4(fgfr4)，导致糖异生关键酶磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(pepck)和葡萄糖-6-磷酸酶(g6pase)的抑制。因此，fxr通过抑制糖异生关键酶和上调fgf19来抑制糖异生。此外，fxr也调节许多参与脂质代谢的基因。在人类和小鼠的研究中已发现，fxr激动剂可以改善葡萄糖稳态、降低血浆甘油三酯水平、减少体重和脂肪量。nr1h4/fxr基因在维持体内葡萄糖和脂质稳态中发挥着重要作用。

2、有研究表明，猪的nr1h4/fxr基因多态性与其皮下脂肪含量和背脂率相关，牛的nr1h4/fxr基因多态性与其皮下脂肪含量、体脂率和体脂分配均相关，但是nr1h4基因与绵羊的脂肪沉积是否相关，具体有何关系，尚不清楚。本发明探讨了绵羊nr1h4基因中单核苷酸多态性(snp)与尾脂沉积之间的关系，为绵羊的后续尾脂相关育种工作提供参考。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种与绵羊尾脂沉积相关的分子标记、其检测方法和应用。本发明的分子标记是从绵羊nr1h4基因中扩增得到，其具体核苷酸序列如seq id no.1所示。通过扩增绵羊nr1h4基因的dna序列并测序，寻找nr1h4基因的多态性位点，分析不同的基因型与绵羊尾脂沉积相关性，并建立含多态性位点的分子标记的检测方法，并可将该分子标记应用于新型优质肉羊新品种的培育中。

2、为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

3、本发明提供了一种与绵羊尾脂沉积相关的分子标记在筛选尾脂沉积少或育种中的应用，该分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，在该序列的第449bp位的碱基w为t或a，由于上述序列在第449位碱基处有一个t/a突变，从而导致了绵羊nr1h4基因在该位点的t/a多态性。当该位点的基因型为at基因型和tt基因型时，其尾脂沉积少，具有较好的养殖效益和更好的市场前景。

4、本发明提供了一种检测上述分子标记的pcr引物对，优选地，其包括正向引物f和反向引物r，所述正向引物f的核苷酸序列如seq id no.2，反向引物r的核苷酸序列如rseqid no.3所示序列。

5、本发明提供了一种检测上述分子标记的kaspar引物对，其包括正向引物a1、正向引物a2和反向引物c，所述正向引物a1的核苷酸序列如se q id no.4所示，所述正向引物2如seq id no.5所示，所述反向引物c如seq id no.6所示

6、一种检测上述分子标记的试剂盒，所述试剂盒中包含了检测上述分子标记的pcr引物对或kaspar引物对。

7、一种检测与绵羊尾脂沉积相关的分子标记的方法，所述分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，其中在该序列的第449bp位的w表示t或a，所述方法包括利用上述的引物对或试剂盒对绵羊的基因组dna进行检测，对获得的扩增产物的多态性位点进行分型鉴定，当测得的基因型为at基因型和tt基因型时，其尾脂沉积少，并可留tt基因型用于育种。

8、具体检测方法包括如下步骤：

9、a)使用上述的pcr引物对、kaspar引物对或包含上述引物对的试剂盒，对绵羊基因组dna进行扩增；

10、b)对步骤a)获得的扩增产物的多态性位点进行鉴定。

11、其中，在步骤b)中，上述分型鉴定的方法包括但不限于直接测序法、探针法、基因芯片法、高分辨率溶解曲线法。

12、利用上述引物对检测与绵羊尾脂沉积相关分子标记的方法，包括如下步骤：

13、a)以绵羊血液为样品提取基因组dna，利用核苷酸序列如seq id no.4、seq idno.5和seq id no.6所示的引物对进行高通量水浴pcr扩增；

14、b)扩增结束后，利用bmg pherastar仪器检测荧光信号并查看分型结果。

15、如上所述的分子标记、pcr引物对、kaspar引物对或试剂盒的检测方法在绵羊尾脂沉积检测中的应用，通过对待测绵羊的基因组dna中检测本发明的分子标记，并分析多态性位点的类型，从而可以确定绵羊的尾脂沉积的高低，进而筛选出在尾脂沉积较低的优势型的绵羊。

16、如上所述的分子标记及其多态性位点、pcr引物对、kaspar引物对或试剂盒的检测方法在绵羊辅助育种中的应用，通过利用上述的引物对或试剂盒对绵羊的基因组dna中进行扩增和检测，确定待测样品的nr1h4基因的基因型，当分子标记的基因型为at基因型和tt基因型时，其尾脂沉积少，从而可以从中选育在尾脂沉积较少的优势型绵羊群体。

17、寻找基因的变异位点，通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系是研究基因功能的一个重要手段，也是进行标记辅助选择的基础。本发明通过对绵羊代表品种绵羊的nr1h4基因进行pcr扩增和测序，发现在扩增片段的第449位存在一个t/a多态性位点，并通过检测849只绵羊nr1h4基因多态性和建立的最小二乘模型，确定了一种与绵羊尾脂沉积相关的分子标记，该分子标记可以用于具有绵羊尾脂沉积少的新型优良肉羊新品种的培育，为绵羊尾脂沉积的遗传改良提供了有效的基因工程手段，缩短了育种周期，具有重大的实际应用价值。

18、本发明的有益效果在于：

19、本发明提供了与绵羊尾脂沉积相关的分子标记，具体为检测绵羊的基因组dna，在seq id no.1片段的第449位的a/g的多态性位点，当该位点的基因型为at基因型和tt基因型时，其具有尾脂沉积少的性能，还提供了检测该分子标记的引物对或检测试剂盒或检测方法在绵羊尾脂沉积相关检测中的应用，通过测定该分子标记的多态性基因型来有效鉴别是否为优势尾脂沉积型的绵羊，能有效筛选出尾脂沉积少的绵羊，为优势尾脂沉积型绵羊的选育提供有效的检测手段。本发明通过对该分子标记及导致多态性位点的检测，可用于选留基因为tt纯合型绵羊作为种羊用于育种，有助于提高绵羊养殖业的经济效益。