一种具有趋化性纳米马达化线粒体及其制备方法和应用

本发明属于生物医药，具体涉及基于一种具有趋化性纳米马达化线粒体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、线粒体是细胞内提供能量的细胞器，提供人体细胞90％的atp，并调控细胞凋亡。线粒体功能障碍会造成atp合成障碍，使人体细胞能量来源不足，导致氧化应激，产生活性等有害物质，引发一系列疾病。

2、线粒体是一种高度动态的细胞器，通过不断融合、分裂维持自身稳态，并且，线粒体已被研究证明可在细胞间转移。目前，线粒体提取技术较为成熟，可以从组织中提取出完整的、有活性的线粒体。线粒体移植是一种新兴的治疗线粒体功能障碍性疾病的方法，外源线粒体能够在受体细胞中与内源线粒体融合、替换功能受损的线粒体，同时增加耗氧率、atp含量和替换损伤的线粒体dna。但由于线粒体的介入时机往往在患病后，线粒体移植并不能及时消除环境中已经存在的活性氧等有害物质，对移植的健康线粒体有着潜在危害，限制了线粒体移植的效率，对线粒体功能障碍性疾病的治疗效果不佳。

3、目前存在的线粒体移植策略主要是通过原位注射或动脉灌注的方式，两种方式都可以将外源线粒体一次性输注到目的区域，但是两种策略实际操作难度高，都存在进一步损伤疾病部位的可能。静脉注射线粒体选择性归巢到疾病部位是具有挑战性的，但它是线粒体移植最有效的策略。为了实现治疗性线粒体靶向递送到疾病部位，必须对线粒体进行修饰改造。

技术实现思路

1、发明目的：针对现有技术存在的问题，尤其是线粒体移植过程中的靶向问题和移植环境差的问题。本发明提供了一种具有趋化性纳米马达化线粒体，赋予线粒体趋化靶向受损部位和消除环境中的ros/inos的能力；同步实现环境中已经存在的活性氧等有害物质的消除，改善线粒体的移植环境。

2、本发明还提供所述具有趋化性纳米马达化线粒体的制备方法和应用。

3、技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种趋化性纳米马达化线粒体，线粒体以及线粒体表面包覆有的聚合物层；所述线粒体活性在修饰过程中不受影响；所述聚合物层中含有高密度活性基团胍基与ros/inos有特异性亲和力。

4、其中，所述线粒体分离自间充质干细胞。如分离自人间充质干细胞。

5、其中，聚合物层中的高密度活性基团胍基与ros/inos有特异性亲和力，可以趋化高ros/inos表达区域。

6、其中，胍基可以消耗环境中已存在的ros/inos，改善线粒体移植环境。

7、本发明所述的趋化性纳米马达化线粒体的制备方法，包括以下步骤：

8、s1、分离提取线粒体分散于缓冲液，得到线粒体悬浊液，保存备用；

9、s2、n-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯(nas)与上述线粒体悬浊液混合反应，使线粒体表面布满双键；

10、s3、用溶解后的精氨酸衍生物和可降解交联剂重悬步骤(2)得到的线粒体，在惰性气体保护下加入加速剂和引发剂形成具有趋化性的纳米马达化线粒体。

11、其中，所有反应都在0-4℃条件下进行。

12、作为优选，所述所有反应都在4℃条件下进行。

13、作为优选，步骤s1中使用细胞线粒体分离试剂盒分离提取线粒体。

14、其中，步骤s2中n-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯的浓度为0.1-2mg/ml，线粒体悬浊液中线粒体的密度为1×108-9-5×108-9个/ml，n-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯与线粒体悬浊液的体积比为1:1-1:5，反应时间为2-6h。

15、其中，步骤s3中所述精氨酸衍生物和交联剂的摩尔比为4:1-15:1，反应时间为6-12小时。

16、作为优选，步骤s3中用溶解后的精氨酸衍生物和交联剂重悬接双键的线粒体，氮气保护下，加入加速剂四甲基乙二胺(temed)和引发剂过硫酸铵(aps)，氮气条件下反应，形成具有趋化性的纳米马达化线粒体，离心后用pbs缓冲液重悬，于冰上放置待用。

17、进一步地，所述精氨酸衍生物和可降解交联剂为二硒交联剂和二硫交联剂。其中se-se键和s-s键可响应ros断裂，便于暴露聚合物层中的胍基。

18、本发明所述的趋化性纳米马达化线粒体在制备治疗线粒体功能障碍疾病药物中的应用。

19、其中，所述药物为喷雾剂或者注射剂。

20、进一步地，所述趋化性纳米马达化线粒体可以自主趋向线粒体存在障碍的疾病部位，与微环境中的ros和inos反应，消耗的同时释放no获得动力，加快细胞摄取。线粒体被摄取后，通过增加atp的产生，替代受损线粒，提高受损细胞的活性，进一步改善细胞氧化应激、钙超载以及炎症反应。

21、本发明利用自由基聚合反应，在线粒体表面原位聚合形成聚合物涂层。在线粒体表面通过nas接双键，作为锚定点。在引发剂和加速剂的作用下，精氨酸衍生物单体和可降解交联剂，通过自由基聚合反应，交联聚合在线粒体表面，形成纳米层。在聚合过程中，精氨酸衍生物单体中的活性基团胍基被保留，其可以与ros/inos反应生成no。对于线粒体障碍组织部位中高表达的ros/inos可作为化学引诱剂，利用酶-底物的特异性亲和力诱导纳米马达化的线粒体向疾病部位趋化，并且移植过程中的同步实现微环境ros和inos消除。经纳米马达化的线粒体具备趋化靶向患病部位能力，在线粒体移植过程中可以进行静脉给药，到达患病部位后改善移植环境，提高移植效率。

22、本发明中利用胍基与ros/inos的反应会产生一氧化氮，通过一氧化氮作为线粒体的调控因子，影响线粒体功能和细胞活性，进而介导疾病的发生与发展。经纳米马达化的线粒体产生的一氧化氮可参与到细胞代谢过程，促进线粒体功能的恢复。

23、本发明制得趋化性纳米马达化线粒体具有良好生物相容性和趋化性，在生物医学领域具有广阔的应用前景。本发明反应过程温和、试剂安全，合成过程中线粒体的生理功能不会遭到破坏。

24、本发明对线粒体进行特定修饰，在不破坏线粒体移植潜力的前提下，赋予线粒体额外的生理功能，有效解决线粒体移植过程中的靶向问题，并同步实现移植环境的改善。

25、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

26、本发明首次通过线粒体进行马达化策略，制备了具有趋化性的纳米马达化线粒体。该方法原料简单，反应条件温和，合成过程中维持了线粒体的生理活性，具备移植潜力。

27、本发明制得的材料具有良好的生物相容性，可以实现体内系统给药。凭借聚合物层中的胍基和ros/inos的特异性亲和力，线粒体选择性趋化受损部位，实现靶向。并且，在受损部位胍基和ros/inos反应会消耗两种有害的活性物质，实现微环境改善，为外源线粒体创造更有利微环境。反应产生的一氧化氮使线粒体具备马达特性，在高活性氧条件下表现为更强的运动能力，细胞摄取率更高。

28、本发明制得的具有趋化性的纳米马达化线粒体可以通过趋化作用增强细胞摄取和组织渗透，从而提高线粒体在体内的靶向效率，并且同步实现疾病为环境的改造，可以有效用于线粒体障碍疾病中，在生物医学领域具有广阔的应用前景。